Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos
Summary
This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
Abstract
A capacidade para manter a função de hepatócitos in vitro, com a finalidade de testar a citotoxicidade 'xenobióticos, estudar a infecção por vírus e o desenvolvimento de drogas orientadas para o fígado, exige uma plataforma em que as células recebem sinais bioquímicos e mecânicos adequados. sistemas recentes de engenharia de tecidos do fígado têm empregado tridimensionais andaimes (3D) compostas de hidrogéis sintéticas ou naturais, dada a sua alta capacidade de retenção de água e sua capacidade de fornecer os estímulos mecânicos necessários pelas células. Tem havido um interesse crescente no andaime invertida cristal coloidal (ICC), um desenvolvimento recente, que permite alta organização espacial, homot�ica e interação célula heterotípica, bem como matriz (ECM) interação célula-extracelular. Aqui, nós descrevemos um protocolo para fabricar o andaime ICC usando poli diacrilato (etileno glicol) (PEGDA) eo método de partículas de lixiviação. Resumidamente, uma estrutura é feita a partir de partículas de microsferas, após o qual uma pré-polymesolução R é adicionada, adequadamente polimerizadas, e as partículas são, então, removido, ou lixiviado, utilizando um solvente orgânico (por exemplo, tetra-hidrofurano). A dissolução dos resultados grades de um andaime altamente porosa com tamanhos de poro controlado e interconnectivities que permitem que os meios para a obtenção de células mais facilmente. Esta estrutura única permite que a área de superfície elevada para as células a aderir bem como a comunicação fácil entre poros, e a capacidade para revestir o andaime ICC PEGDA com proteínas também mostra um efeito significativo no desempenho da célula. Analisamos a morfologia do suporte, bem como a célula hepatocarcinoma comportamento (Huh-7,5), em termos de viabilidade e função para explorar o efeito da estrutura ICC e revestimentos de ECM. No geral, este artigo fornece um protocolo detalhado de um andaime emergente que tem larga aplicação em engenharia de tecidos, especialmente no fígado engenharia de tecidos.
Introduction
O fígado é um órgão altamente vascularizado com uma multiplicidade de funções, incluindo a desintoxicação do sangue, metabolismo de xenobióticos, e a produção de proteínas séricas. O tecido de fígado tem uma microestrutura complexa tridimensional (3D), que compreende de vários tipos de células, canalículos biliares, sinusóides, e zonas de composição biomatriz diferente e diferentes concentrações de oxigénio. Dada esta estrutura elaborada, tem sido difícil criar um modelo de fígado adequada in vitro 1. No entanto, há uma crescente demanda por funcional em modelos in vitro hospedagem hepatócitos humanos como plataformas para ensaio da toxicidade da droga 2 e estudo de doenças associadas ao fígado 3.
Plataformas de engenharia de tecidos de fígado actual simplificaram a complexidade do fígado através do isolamento de um, ou concentrando-se em alguns, dos parâmetros do fígado, isto é, a co-cultura de células de 4 composição, bioquímica da Zonal microambientes 5, dinâmica de fluxo de 6,7 e a configuração da Biomatriz 8. Configuração da biomatriz pode ser dividida em parâmetros, tais como materiais de andaime, a composição de proteínas da matriz extracelular (ECM), a rigidez da matriz, bem como da concepção e estrutura do andaime. Houve um aumento nos estudos de engenharia de tecidos utilizando hidrogeles sintéticos, especialmente poli (etilenoglicol) (PEG) hidrogéis 9, dada a capacidade de ajustar as propriedades, bioactividade, e taxa de degradação mecânica do hidrogel. Em relação à investigação relacionada com o fígado, o hidrogel biocompatível foi aplicado para estudar a infecção pelo vírus da doença hepática 3. Como um projeto de plataforma de hepatócitos, numerosos estudos têm utilizado hepatócitos sanduíche culturas 10,11 e encapsulamento de células dentro de um hidrogel 12,13 para proporcionar o ambiente 3D e célula-ECM e interação célula-célula, que são essenciais para imitar no microambiente vivo. However, essas plataformas não possuem um alto grau de controle e organização espacial, levando a propriedades não uniformes através do andaime 14.
O coloidal cristal invertido (ICC) 14 scaffold é um arcabouço 3D altamente organizada para cultura de células, que foi introduzido pela primeira vez no início de 2000. estrutura única do andaime pode ser atribuída ao processo de fabricação simples utilizando um cristal coloidal, uma estrutura ordenada de partículas coloidais de diâmetro variável. Resumidamente, para resumir o processo, as partículas são dispostas ordenadamente e recozidos usando o calor para formar uma rede. A lixiviação desta estrutura, por um solvente orgânico, em um polimerizados resultados de hidrogel em cavidades esféricas hexagonal embalados 15 com área de superfície elevada. Este andaime altamente ordenada tenha sido previamente feito com ambos os materiais sintéticos e naturais, incluindo, mas não limitados a poli (acrilamida) 16-21, poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) 15,22-30, Poli (etileno-glicol) 31,32, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) 21,33-35, e quitosano 36-39. Andaimes ICC feitas de materiais não-incrustantes tendem a promover esferóides celulares no interior das cavidades 14,23,40. Vários tipos de células têm sido mostrados para proliferar com sucesso, diferenciação e função dentro desta configuração, incluindo condrócitos 41, células do estroma da medula óssea 42, e as células-tronco 43,44. Em relação hepatócito, estudos têm sido realizados com andaimes ICC feitas de Na 2 SiO 3 e poli (acrilamida), mas não PEG. Com estratégias bioconjugação simples (ou seja, o acoplamento de amina através EDC / NHS), scaffolds à base de PEG ECM proteínas conjugadas podem ser fabricados, que podem revelar-se locais de ligação mais celulares para ser um mais in vivo, como o ambiente e melhorar a função hepática.
Neste manuscrito e o vídeo associado, detalhamos a fabricação do andaime ICCusando poli (etileno-glicol) diacrilato de hidrogel (PEGDA) e um látice de poliestireno microesfera, optimizado para hepatocarcinoma (Huh-7,5) cultura. Nós demonstrar as diferenças entre os nus andaimes ICC PEGDA geralmente não aderentes eo PEGDA ICC andaime revestido de colágeno em termos de topologia de andaime e desempenho celular. viabilidade e função celular são medidos qualitativa e quantitativamente avaliar o comportamento das células Huh-7.5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Andaimes de engenharia de tecidos estão a evoluir rapidamente para fornecer todas as pistas físicas e bioquímicas necessárias para regenerar, manter ou reparar tecidos para a aplicação da substituição de órgãos, estudando a doença, o desenvolvimento de drogas, e muitos outros 57. Na engenharia de tecidos do fígado, os hepatócitos primários humanos rapidamente perdem suas funções metabólicas uma vez isolados do corpo, criando uma grande necessidade de andaimes de engenharia e desenvolvimento d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o apoio de um Research Foundation Fellowship Nacional (NRF -NRFF2011-01) e Competitiva Programa de Pesquisa (NRF-CRP10-2012-07).
Materials
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
| Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
| Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
| Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
| Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
| Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
| Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
| Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
| Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
| Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
| Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
| Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
| 100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
| Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (to be chosen) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
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