Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a fabricação de uma plataforma emergente de cultura de hepatócitos tridimensionais, o andaime de cristal coloidal invertido e as técnicas concomitantes para avaliar o comportamento dos hepatócitos. Os poros controláveis por tamanho, a interconectividade e a capacidade de conjugar proteínas da matriz extracelular ao andaime de poli (etilenoglicol) (PEG) aumentam o desempenho das células Huh-7.5.
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Artigo de método
Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A capacidade para manter a função de hepatócitos in vitro, com a finalidade de testar a citotoxicidade 'xenobióticos, estudar a infecção por vírus e o desenvolvimento de drogas orientadas para o fígado, exige uma plataforma em que as células recebem sinais bioquímicos e mecânicos adequados. sistemas recentes de engenharia de tecidos do fígado têm empregado tridimensionais andaimes (3D) compostas de hidrogéis sintéticas ou naturais, dada a sua alta capacidade de retenção de água e sua capacidade de fornecer os estímulos mecânicos necessários pelas células. Tem havido um interesse crescente no andaime invertida cristal coloidal (ICC), um desenvolvimento recente, que permite alta organização espacial, homot�ica e interação célula heterotípica, bem como matriz (ECM) interação célula-extracelular. Aqui, nós descrevemos um protocolo para fabricar o andaime ICC usando poli diacrilato (etileno glicol) (PEGDA) eo método de partículas de lixiviação. Resumidamente, uma estrutura é feita a partir de partículas de microsferas, após o qual uma pré-polymesolução R é adicionada, adequadamente polimerizadas, e as partículas são, então, removido, ou lixiviado, utilizando um solvente orgânico (por exemplo, tetra-hidrofurano). A dissolução dos resultados grades de um andaime altamente porosa com tamanhos de poro controlado e interconnectivities que permitem que os meios para a obtenção de células mais facilmente. Esta estrutura única permite que a área de superfície elevada para as células a aderir bem como a comunicação fácil entre poros, e a capacidade para revestir o andaime ICC PEGDA com proteínas também mostra um efeito significativo no desempenho da célula. Analisamos a morfologia do suporte, bem como a célula hepatocarcinoma comportamento (Huh-7,5), em termos de viabilidade e função para explorar o efeito da estrutura ICC e revestimentos de ECM. No geral, este artigo fornece um protocolo detalhado de um andaime emergente que tem larga aplicação em engenharia de tecidos, especialmente no fígado engenharia de tecidos.
Introdução
O fígado é um órgão altamente vascularizado com uma multiplicidade de funções, incluindo a desintoxicação do sangue, metabolismo de xenobióticos, e a produção de proteínas séricas. O tecido de fígado tem uma microestrutura complexa tridimensional (3D), que compreende de vários tipos de células, canalículos biliares, sinusóides, e zonas de composição biomatriz diferente e diferentes concentrações de oxigénio. Dada esta estrutura elaborada, tem sido difícil criar um modelo de fígado adequada in vitro 1. No entanto, há uma crescente demanda por funcional em modelos in vitro hospedagem hepatócitos humanos como plataformas para ensaio....
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Protocolo
1. ICC andaime Fabrication (Figura 1)
- Prepare o poliestireno (PS) reticulados (diâmetro = 6 mm; 8-13 camadas de grânulos).
- Para preparar o molde, corte as pontas off de 0,2 ml tubos de microcentrífuga à prova de fervura no nível de 40 mL. Aderir ao topo das cut-tubos de 24 x 60 milímetros 2 microscópio lamelas de vidro com cola à prova de água.
- Coloque as esferas PS (diâmetro = 140 um) contidos dentro de uma suspensão de água em um frasco de 20 ml, cuidadosamente pipetar a suspensão em água, e adicionar 18 ml de solução a 70% de etanol para dentro do frasco. Coloque a solução esfera em um banho ultra-sônico para soltar esferas....
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Resultados
Os resultados representativos para a caracterização estrutural do andaime ICC ea comparação da eficácia de cada condição de andaime ICC em cultura de hepatócitos são mostrados e explicados abaixo. As condições ICC andaime utilizados nestes resultados são revestimentos de colagénio de 0 ug / ml (sem isolamento), 20 ug / ml (colágeno 20), 200 ug / ml (colágeno 200), e 400 ug / ml (colágeno 400) e o inicial huh-7.5 número de semeadura de células é 1x10 6.
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Discussão
Andaimes de engenharia de tecidos estão a evoluir rapidamente para fornecer todas as pistas físicas e bioquímicas necessárias para regenerar, manter ou reparar tecidos para a aplicação da substituição de órgãos, estudando a doença, o desenvolvimento de drogas, e muitos outros 57. Na engenharia de tecidos do fígado, os hepatócitos primários humanos rapidamente perdem suas funções metabólicas uma vez isolados do corpo, criando uma grande necessidade de andaimes de engenharia e desenvolvimento de plataformas par.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o apoio de um Research Foundation Fellowship Nacional (NRF -NRFF2011-01) e Competitiva Programa de Pesquisa (NRF-CRP10-2012-07).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de PCR de 0,2 ml | Axygen Scientific | PCR-02D-C | à prova de fervura |
| Gorilla Glue, Inc. | Depende do fornecedor. Isso foi comprado em uma loja local. | ||
| Corrediças de vidro | VWR | 631-1575 | Dimensões: 24&vezes; Esferas de poliestireno de 60 mm2 |
| Poliestireno | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diâmetro = 140 µ m; 3x104 partículas por mililitro e distribuição de tamanho de 1,4% |
| Etanol | Merck | 1.00983.1011 | absoluto para análise EMSURE; Dilua a 70% com Milli-Q água |
| Ultrassônica Banho | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 µ l ponta de pipeta | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Agitador oscilante | VWR | 444-0142 | |
| Polietilenoglicol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4 kDa; a acrilação dos monômeros PEG e a purificação do precipitado resultante produzem um macrómero PEGDA com Mw = 4.6 |
| Centrífuga | kDa Beckman Coulter | 392932 | Equipamento |
| Acrilato-Poli (Etilenoglicol) - Valerato de Succinimidil | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3,4 kDa |
| 2-hidroxi-4'- (2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Equipamento |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Parafina Filme | Parafilme M | #PM996 | Mantido em 9" com intensidade permitida de 10,84 mW/cm2 |
| Bluewave 200 Refletor UV | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahidrofurano (THF) | Merck | 107025 | |
| agitador orbital | Heidolph | 543-123120-00-5 | |
| Colágeno Tipo I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | De rato. 1x, sem CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10 x 10 ml |
| Paraformaldeído | VWR | 43368.9M | |
| Equipamento Freezone 4.5 liofilizador | Labconco | 7750020 | Equipamento |
| Revestidor por pulverização catódica | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipamento |
| de Microscópio Eletrônico de Varredura | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anti-mouse anticorpos primários contra Colágeno tipo I | Abcam | ab6308 | |
| Anti-camundongo anti-camundongo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Placa, Cultura de Tecidos 24 Poços, Fundo Plano (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) 2,5 g / L Glicose com L-Gln | Soro Fetal Bovino Lonza | 12-604F | |
| (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicilina-Estreptomicina (P / S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| 100 mm Corning pratos de cultura não tratados | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipamento; 37 ° C, 5% de Umidade |
| Forma Ciclo Esterilizado CO2 Incubadoras | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Hemacitômetro de Fase Bright-Line | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Kit de Viabilidade/Citotoxicidade Vivo/Morto para células de mamíferos | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Ensaio | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Reagente de sal monossódico (MSR) |
| Leitor de microplacas Infinite 200 PRO | Kit ELISA | ||
| Abcam ab108788 | |||
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anticorpos primários anti-camundongo (contra CYP3A4, albumina) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 marcado com faloidina | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Clorofórmio | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC água | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop Espectrofotômetro 2000c | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Transcrição Reversa Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR selecionam Master Mix para CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (a serem escolhidos) | |||
| Sistema de Tempo Real CFX96, Termociclador de Toque C-1000 | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
Referências
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Abboud, G., Kaplowitz, N.
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Reimpressões e permissões
