This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
Förmågan att upprätthålla hepatocyte funktion in vitro, i syfte att testa xenobiotika "cytotoxicitet, studera virusinfektion och utveckla läkemedel som riktar sig till levern, kräver en plattform där celler får rätt biokemiska och mekaniska signaler. Senaste levervävnad tekniska system har använt tredimensionella (3D) ställningar bestående av syntetiska eller naturliga hydrogeler, med tanke på deras höga vattenbindande och deras förmåga att ge de mekaniska stimuli som behövs av cellerna. Det har funnits ett växande intresse för den inverterade kolloidalt kristallen (ICC) byggnadsställning, en ny utveckling, vilket möjliggör hög rumslig organisation, homotypisk och hetero cell interaktion, liksom cell extracellulärt matrix (ECM) interaktion. Häri beskriver vi ett protokoll för att tillverka ICC ställningen med användning av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) och urlakningspartikelmetoden. Kortfattat är ett gitter tillverkat av mikrosfärpartiklar, varefter en i förväg polymer lösning tillsättes, korrekt polymeriseras, och partiklarna avlägsnas därefter, eller urlakas, med användning av ett organiskt lösningsmedel (t.ex. tetrahydrofuran). Upplösningen av gitterresulterar i en mycket porös scaffold med kontrollerade porstorlekar och interconnectivities som tillåter medier för att nå cellerna lättare. Denna unika struktur tillåter en hög ytarea för cellerna att vidhäfta till samt enkel kommunikation mellan porerna, och möjligheten att belägga PEGDA ICC scaffold med proteiner visar också en markant effekt på cellprestanda. Vi analyserar morfologi ställningen samt hepatokarcinom cellen (Va-7,5) beteende när det gäller lönsamhet och funktion för att undersöka effekten av ICC struktur och ECM beläggningar. Sammantaget ger detta papper ett detaljerat protokoll av en framväxande byggnadsställning som har breda tillämpningar inom tissue engineering, särskilt levervävnadsteknik.
Levern är ett mycket vaskulariserad organ med en mängd funktioner, inklusive avgiftning av blodet, metabolism av xenobiotika, och produktionen av serumproteiner. Levervävnad har en komplex tredimensionell (3D) mikrostruktur, bestående av flera celltyper, gallcanaliculi, sinuskurvor, och zoner med olika biomatris sammansättning och olika syrekoncentrationer. Med tanke på detta noggrant struktur, har det varit svårt att skapa en ordentlig levermodell in vitro en. Det finns dock en ökande efterfrågan på funktionella in vitro-modeller värd humana hepatocyter som plattformar för att testa läkemedelstoxicitet 2 och studera sjukdomar associerade med levern 3.
Aktuell levervävnadstekniska plattformar har förenklat komplexiteten av levern genom att isolera en eller fokusera på ett fåtal av leverns parametrar, nämligen co-odling av celler 4, biokemisk sammansättning zonal mikromiljöer 5, flödesdynamik 6,7 och konfigurationen av biomatris 8. Konfiguration av biomatris kan delas in parametrar såsom ställningsmaterial, sammansättningen av extracellulär matris (ECM) -proteiner, matris styvhet samt utformningen och konstruktionen av byggnadsställningen. Det har skett en ökning i vävnadsingenjörsstudier med syntetiska hydrogeler, särskilt poly (etylenglykol) (PEG) hydrogeler 9, ges möjlighet att ställa hydrogelen mekaniska egenskaper, bioaktivitet och nedbrytning takt. När det gäller leverrelaterad forskning, var det biokompatibla hydrogelen ansökt om virusinfektion studie av leversjukdom 3. Som en hepatocyte plattform konstruktion, har många studier utnyttjade levercell sandwich kulturer 10,11 och cell inkapsling i en hydrogel 12,13 för att ge 3D-miljö och cell ECM och interaktion cell-cell som är nödvändiga för att efterlikna in vivo mikromiljö. However, dessa plattformar inte har en hög grad av kontroll och fysisk planering, vilket leder till icke-likformiga egenskaper genom ställningen 14.
Den inverterade kristall kolloidalt (ICC) 14 Ställningen är en mycket organiserad 3D byggnadsställning för cellodling som först introducerades i början av 2000-talet. Ställningen unika struktur kan hänföras till den enkla tillverkningsprocessen med användning av en kolloidal kristall, en ordnad gitter av kolloidala partiklar av varierande diameter. I korthet, för att sammanfatta processen partiklar är prydligt ordnade och glödgade hjälp av värme för att bilda ett galler. Urlakningen av detta gitter, genom ett organiskt lösningsmedel, i en polymeriserad hydrogel resulterar i hexagonalt packade sfäriska kaviteter 15 med hög ytarea. Denna höggradigt ordnad scaffold tidigare har gjorts med både syntetiska och naturliga material, inklusive men inte begränsat till poly (akrylamid) från 16 till 21, poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) 15,22-30, Poly (etylenglykol) 31,32, poly (2-hydroxietylmetakrylat) 21,33-35, och kitosan 36-39. ICC byggnadsställningar tillverkade av icke-fouling material tenderar att främja cellulära sfäroider inuti håligheterna 14,23,40. Flera celltyper har visat sig framgångsrikt proliferera, differentiera och fungera inom denna konfiguration, inklusive kondrocyter 41, benmärgsstromaceller 42, och stamceller 43,44. Beträffande hepatocyt, har studier utförts med ICC ställningar gjorda av Na 2SiO 3 och poly (akrylamid), men inte PEG. Med enkla biokonjugering strategier (dvs aminkoppling via EDC / NHS), kan ECM-proteiner-konjugerade PEG-baserade stödstrukturer tillverkas, som kan visa sig vara mer cellbindningsställen för att vara en mer in vivo liknande miljö och förbättra leverfunktion.
I detta manuskript och tillhörande video, är vi i detalj tillverkningen av ICC ställningenmed användning av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) hydrogel och en polystyren mikrosfärer galler, optimerad för hepatokarcinom (Va-7,5) kultur. Vi visar skillnaderna mellan de i allmänhet icke-adhesiva nakna PEGDA ICC byggnadsställningar och det kollagenbelagda PEGDA ICC scaffold i form av byggnadsställning topologi och cellprestanda. Cellviabilitet och funktion mäts kvalitativt och kvantitativt bedöma Huh-7,5 cellens beteende.
Vävnadstekniska byggnadsställningar utvecklas snabbt för att ge alla de fysiska och biokemiska signaler som är nödvändiga för att regenerera, underhålla eller reparera vävnad för tillämpningen av ersättnings organ, studera sjukdomar, utveckling av läkemedel och många andra 57. I levervävnadsteknik, primära humana hepatocyter förlorar snabbt deras metaboliska funktioner när isolerade från kroppen, vilket skapar ett stort behov av tekniska ställningar och utveckla plattformar för att upprä…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna stöd från en National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) och konkurrenskraftig forskning (NRF-CRP10-2012-07).
0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
DAPI | Life Technologies | D3571 | |
Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
Chloroform | VWR | 22706.326 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
Primers (to be chosen) | |||
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |