親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション
Summary
親油性のドキソルビシンプロドラッグの調製および特徴付けのためのプロトコルは、1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- Nロード- [アミノ（ポリエチレングリコール）-2000]の（DSPE-PEG）ミセルが記載されています。
Abstract
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Introduction
化学療法は一般に、癌の種々の形態を治療するために使用されます。すべてではないが、ほとんどは、化学療法薬は、より多くの生命を脅かす条件に、このような吐き気や下痢などの管理がマイナー条件と異なる場合があり毒性の副作用を持っています。ほとんどの抗がん剤は毒性があるので、正常組織へのこれらの薬剤の非選択的露光は、必然的に毒性を引き起こします。したがって、選択的に癌細胞に薬物を送達することができる治療的アプローチのための大きい必要性があります。抗がん剤の投与と別の課題は、それらの難水溶性です。通常、可溶化剤は、これらの難溶性薬物を処方するために必要とされます。しかし、ほとんどの可溶化ジメチルスルホキシド（DMSO）、クレモフォールELなどの薬剤、およびポリソルベート80（ツイーン80）は、肝臓と腎臓毒性、溶血、急性過敏性反応や末梢神経障害を引き起こす可能性があります。1ので、安全で、生体適合性の製剤は、のために必要とされています貧しい人々の臨床使用LY可溶性抗癌剤。ナノキャリアは、上記の課題に対処するための薬物送達システムが期待されています。これらのナノキャリアは、リポソーム、2ナノ粒子、3ミセル、4-7ポリマー-薬物コンジュゲート、8および無機材料が挙げられる。9、いくつかのナノ医療製品は、（ 例えば 、ドキシル、アブラキサン、およびGenexol）は癌患者を治療するための規制当局によって承認されています。 10
高分子ミセルは、正常抗癌剤を送達するために使用されているナノスケール薬物送達キャリアを、期待されている。4-7,11,12典型的な高分子ミセルは、自己組織化プロセスを介して両親媒性ポリマーから調製されます。コア – シェル構造化された高分子ミセルは、親水性シェルと疎水性コアを含みます。親水性シェルは、立体的にミセルを安定化し、血流での循環を延長することができます。疎水性コアは、効果的に疎水性Dをカプセル化することができますラグ。そのため、小さなミセルのサイズ（一般的には200nm未満）および長期循環特性により、高分子ミセルは、強化された透過性および保持（EPR）効果（受動的腫瘍標的）を介して腫瘍ターゲッティングを達成すると考えられています。
薬物負荷の安定性は、ミセルの能力を腫瘍ターゲティングのために重要です。最適な腫瘍標的化を達成するために、ミセルは、腫瘍部位に到達する前に、最小限の薬物の漏出を有し、まだすぐにがん細胞を入力した後に薬物を放出すべきです。製剤の安定性は、製品開発の実現可能性、ならびに開発された製品の貯蔵寿命を決定するために加えて、製剤の安定性は、製品開発のための必須要件です。最近、多くの努力は、送達担体への薬物の負荷を改善するためになされています。親油性プロドラッグアプローチは、脂質ナノ粒子及び乳剤に薬物負荷を改善するために検討されている戦略である。13,14 CONJ薬物と脂質のugationは大幅に親油性を向上させ、ナノキャリアの親油性成分でロードと保持を高めることができます。
ここでは、親油性のドキソルビシンプロドラッグロードミセルを調製するためのプロトコルについて説明します。まず、親油性プロドラッグをドキソルビシンの合成手順を説明します。その後、膜分散法を用いてミセルを生成するためのプロトコルが導入されます。この方法は、正常に我々の以前の研究で使用されてきた。それは、正常ミセル薬物送達のために使用されているため、5 DSPE-PEGは、ミセルを調製するための担体材料として選択した。15,16最後に、我々は、ミセルを特徴付けるために使用されるいくつかのインビトロアッセイを記載抗癌活性を評価するための製剤および。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、ミセルの調製のための単純、迅速なフィルム分散法を説明します。この方法は、水性環境中でコアシェル構造のミセルを形成する両親媒性ポリマー（ 例えば 、DSPE-PEG）の自己集合特性を利用します。このミセルの調製方法は、いくつかの利点を有します。 1.これは、一般的に、リポソーム、ナノ粒子、およびナノエマルジ ョンの調製に使用される（例えば、押出し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
Materials
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
References
- Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?. ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
- Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
- Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
- Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd, ., D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
- Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
- Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).
- Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
- Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
- Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
- Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles – a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
- Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
- Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2′-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
- Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
- Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
- Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
- Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
- Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
- Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
- Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
- Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
- Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).
