Lipofilik Doksorubisin Pro-ilaç misellerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu
Summary
Lipofilik doksorubisin ön-ilacın hazırlanması ve tanımlanması için bir protokol, 1,2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanolamine- N yüklü – [amino (polietilen glikol) -2000] (DSPE-PEG) miseller anlatılmıştır.
Abstract
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Introduction
Kemoterapi genellikle çeşitli kanser tiplerini tedavi etmek için kullanılır. hepsi değilse de çoğu, kemoterapi ilaçları daha fazla yaşamı tehdit eden koşullara, bulantı ve ishal gibi yönetilebilir küçük koşullar değişebilir toksik yan etkileri vardır. En antikanser ilaçların toksik olduğundan, normal dokuya bu ilaçların seçici olmayan maruz kaçınılmaz toksisiteye neden olur. Bu nedenle, seçici bir şekilde kanser hücrelerine ilaç teslim bir terapötik yaklaşım için büyük bir ihtiyaç vardır. antikanser ilaçların verilmesi ile diğer zorluk da kötü su çözünürlüğü olduğunu. Genellikle, çözündürücü maddeler, bu az çözünen ilaçların formüle edilmesi gereklidir. Bununla birlikte, dimetil sülfoksit gibi en çözündürücü maddeler, (DMSO), Cremophor EL, ve polisorbat 80 (Tween 80), karaciğer ve böbrek toksisitesi, hemoliz, akut yüksek tansiyon tepkilerine ve periferal nöropatiler neden olabilir. 1 Bu nedenle, güvenli ve biyo-uyumlu formülasyonlar için gerekli olan yoksul klinik kullanımıly çözünür antikanser ilaçlar. Nanocarriers yukarıdaki zorlukları ele almak için ilaç taşıyıcı sistemleri umut vericidir. Bu nanocarriers lipozomlar, 2 nano-tanecikleri, 3 miseller, 4-7, polimer-ilaç konjügatları, 8 ve inorganik malzemeler bulunmaktadır. 9 Çeşitli Nanomedicine ürünleri (örneğin, Doxil, Abraxane ve Genexol) kanser hastalarının tedavisinde düzenleyici kurumlar tarafından onaylanmıştır. 10
Polimerik miseller başarılı antikanser ilaçların verilmesi için kullanılan nano ölçekli ilaç verme taşıyıcılar, umut vericidir. 4-7,11,12 tipik bir polimerik miseller kendinden montaj işlemi boyunca amfifil polimerlerle hazırlanır. Çekirdek-kabuk yapılı polimer miseller bir hidrofilik ve bir hidrofobik kabuk çekirdek bulunmaktadır. hidrofil kabuk sterik miseller stabilize ve kanda kendi dolaşımını uzatabilir. hidrofobik çekirdek etkin bir şekilde hidrofobik d sarabilirizkilim. Çünkü miseller (tipik olarak en az 200 nm) ve uzun sirkülasyon özelliklerinin küçük boyutu, polimerik miseller gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkileri (pasif tümör hedefleme) ile hedef tümör elde inanılmaktadır.
İlaç yükü stabilite miseller yeteneğini hedef tümör için önemlidir. Optimal tümör hedefleme ulaşmak için, misel tümör sitesine ulaşmadan önce en az ilaç sızıntısı, henüz hızlı bir şekilde kanser hücrelerini girdikten sonra ilacı tahliye edilmelidir. formülasyon istikrar ürün geliştirme fizibilite yanı sıra geliştirilen ürünlerin raf ömrünü belirler, çünkü ek olarak, formülasyon stabilitesi, aynı zamanda ürün geliştirme için temel bir gerekliliktir. Son zamanlarda, çok çaba dağıtım taşıyıcılara ilaçların yükleme geliştirmek için yapılmıştır. Lipofilik ön-ilaç bir yaklaşım lipit nanopartiküller ve emülsiyonlar halinde ilaç yüklemesine geliştirmek için araştırılmaktadır bir stratejidir. 13,14 conjilaçlarla lipidlerin ugation önemli ölçüde iyileştirmek ve lipofilliğini nanocarriers lipofilik bileşenleri yükleme ve tutma artırabilir.
Burada, lipofilik doksorubisin yanlısı ilaç yüklü miseller hazırlamak için bir protokol açıklar. İlk olarak, lipofilik yanlısı ilaç doksorubisin için sentez prosedürü tarif edilmektedir. Daha sonra, bir film-dispersiyon yöntemi ile miseller oluşturmak için bir protokol verilmektedir. Bu yöntem, başarılı bir şekilde daha önceki çalışmalarda kullanılmıştır. 5 DSPE-PEG başarıyla misel ilaç verilmesi için kullanılmıştır, çünkü miseller hazırlanması için taşıyıcı malzeme olarak seçilmiştir. 15,16 Son olarak, misel karakterize etmek için kullanılan çeşitli in vitro analizler açıklanmaktadır formülasyonlar ve antikanser aktivitesini değerlendirmek için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, miseller hazırlanması için basit ve hızlı bir film-dispersiyon bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir amfifilik polimerin kendinden montaj özelliklerinden istifade (örneğin, DSPE-PEG) sulu bir ortamda çekirdek-kabuk yapılı miseller oluşturmak için. Bu misel hazırlama yöntemi birçok avantaja sahiptir. 1. Genellikle lipozom, nanopartiküller ve nanoemülsiyonlar. 19 2 hazırlanmasında kullanılan (örneğin, haddeleme ya da homojenizasyon gibi) karışık büy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
Materials
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
References
- Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?. ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
- Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
- Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
- Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd, ., D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
- Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
- Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).
- Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
- Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
- Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
- Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles – a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
- Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
- Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2′-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
- Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
- Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
- Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
- Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
- Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
- Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
- Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
- Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
- Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).
