Три тепла представлены методы осаждения, которые эффективно удалить более 90% белков клетки-хозяина (НСР) из экстракта табака до любой другой стадии очистки. Завод НСР необратимо агрегировать при температурах выше 60 ° C.
Растения не только обеспечивают продуктов питания, кормов и сырья для человека, но также были разработаны в качестве экономичной системы производства для биофармацевтических белков, таких как антитела, вакцин-кандидатов и ферментов. Они должны быть очищены от биомассы растений, но хроматографические стадии мешают высокие концентрации белков клетки-хозяина (НСР) в растительных экстрактах. Тем не менее, большинство НСР необратимо агрегировать при температурах выше 60 ° C, облегчающих последующую очистку целевого белка. Здесь три метода представлены для достижения осаждению тепла табака ВДС в или интактными, листьев или экстрактов. Побледнение неповрежденных листьев можно легко встроить в существующие процессы, но может оказать негативное влияние на последующих стадиях фильтрации. Обратное верно для осаждения тепла листьев экстрактов в сосуде с мешалкой, которая может улучшить производительность последующих операций, хотя и с основными изменениями в конструкции технологического оборудования, таких какГомогенизатор геометрии. И, наконец, установка теплообменника хорошо характеризуется с точки зрения условий теплообмена и легко масштабировать, но очистка может быть затруднена и может быть негативное влияние на емкость фильтра. Подход дизайн-оф-экспериментов могут быть использованы для идентификации наиболее релевантных параметров процесса, влияющих на удаление HCP и восстановление продукта. Это облегчает применение каждого метода в других платформ экспрессии и определения наиболее подходящего метода для данной стратегии очистки.
Современные системы здравоохранения все больше зависят от биофармацевтических белков 1. Производство этих белков в растениях является предпочтительным из – за низкой нагрузки патогена и большую масштабируемость по сравнению с традиционными системами экспрессии 2-4. Тем не менее, ниже по течению обработки (DSP) растительного происхождения, лекарственных средств может быть сложной задачей, поскольку подрывные процедуры извлечения приводят к высоким бременем частиц, мути превышающей 5000 нефелометрическая единиц мутности (модулей NTU), и клетка-хозяин белка (HCP) концентрации часто превышает 95 % [м / м] 5,6.
Сложные процедуры осветления необходимо удалить дисперсные частицы 7-9, но хроматографию оборудование является менее дорогостоящим для работы в режиме связывания-и-Элюции во время первоначального восстановления продукта , если есть более ранний шаг для эффективного удаления ВДС 10,11. Это может быть достигнуто либо путем осаждения белка-мишени с использованием flocculМуравьи 12 или с низким рН 13,14, а также в результате чего НСР в совокупности. Селективная агрегация рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы (RuBisCO), наиболее распространенным НСР в зеленых растениях , таких как табак (Nicotiana аЬасит), может быть ускорена добавлением полиэтиленгликоль 15, но это дорого и несовместимыми с большой -scale производства. Термообработка Было показано , что денатурации и выпадают в осадок более 95% табака ВДС, в то время как кандидаты вакцинных белок малярии , такие как Vax8 остаются стабильными в растворе 16-18.
Три различных подхода были использованы для достижения осаждения термически индуцированные табака ВДС: (I) бланширование, т.е. погружение интактных листьев в горячей жидкости, (II) с регулируемой температурой с мешалкой, и (III) , теплообменник ( Рисунок 1) 16. Для неповрежденных листьев, бланширование достигается быстрое и эффективное осаждение ВДС и также легкодля расширения и совместимо с существующими производственными процессами крупномасштабных , которые включают начальный шаг для мытья биомассы растений 19. В противоположность этому , с контролем температуры сосуды уже доступны в некоторых процессах , и может быть использован для термической обработки растительных экстрактов 20, но их масштабируемость и скорость передачи энергии ограничены , так как отношение поверхности к объему резервуаров постепенно уменьшается и становится непригодным в процессе масштабе. Теплообменник представляет собой технически четко определенной альтернативой нагревали с мешалкой , но требует обильный запас нагрева и охлаждения сред, например, пара и холодной воды, а также жестко контролируемой объемной скорости потока , который адаптирован к геометрии теплообменника и СМИ свойствами, например., удельная теплоемкость. В этой статье показано, как все три метода могут быть использованы для осаждения термически индуцированные табака ВДС и растений ВДС в целом. Создание и эксплуатация EACМетод ч в лабораторных условиях могут быть использованы для оценки их пригодности для более масштабных процессов. Основная задача состоит в том, чтобы определить адекватные модели масштаба вниз и рабочие условия для каждой операции, напоминающие устройства и условия, используемые в процессе серийного производства. Данные , представленные здесь , относятся к экспериментов , проведенных с трансгенных растений табака , экспрессирующих вакцины от малярии кандидат Vax8 и флуоресцентный белок DsRed 16, но этот метод также был успешно применен к N. benthamiana растения скоротечно экспрессирующие другие биофармацевтические белки 21.
А дизайн-оф-экспериментов (DOE) подход 22 может способствовать развитию процесса, и флокулянтов 23 также может быть полезным в этом контексте , как описано выше 8. Основное различие между бланширование, нагреваемых сосудов и теплообменников, что бланширование применяется к неповрежденным листьев на ранней стадии процесса, тогда как ВЗее наносят на растительные экстракты (рисунок 1).
Рисунок 1:. Схема процесса Схема Иллюстрируя реализации трех различных методов Tobacco HCP тепла Осадки Растительный материал промывают и гомогенизируют перед осветлением и очистки. Оборудование для бланширования (красного цвета), могут быть легко добавлены к существующей техники. В противоположность этому , используя перемешанную сосуд (оранжевый) и особенно теплообменник (синий) требуется один или несколько дополнительных устройств и трубок. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Три метода для осаждения тепла , описанные выше , могут эффективно удалить табака HCPS до какого – либо хроматографической стадии очистки 16,17. Они дополняют другие стратегии , которые направлены на увеличение первоначальной чистоты продукта, например, гуттация 29, rhizosecretion <…
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes and Veronique Beiß for providing the transgenic tobacco seeds, and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. The authors wish to thank Dr. Richard M. Twyman for editorial assistance as well as Güven Edgü for providing the MSP1-19 reference. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
Blender | Waring | 800EG | Blender |
BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
Cuvette 10x10x45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
Sodium disulfit | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
Stainless-steel vessel; 0.7-kg 2.0-L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |