Eccitazione esterna dei neuroni Usando campi elettrici e magnetici in mono e culture bidimensionali

Summary

colture neuronali sono un buon modello per lo studio delle tecniche di stimolazione cerebrale emergenti tramite il loro effetto sui singoli neuroni o di una popolazione di neuroni. Qui presentati sono diversi metodi per la stimolazione di colture neuronali modellate da un campo elettrico prodotto direttamente dalla elettrodi bagno o indotto da un campo magnetico variabile nel tempo.

Abstract

Un neurone spara un potenziale d'azione quando il suo potenziale di membrana supera una certa soglia. Nell'attività tipica del cervello, questo si verifica come risultato di ingressi chimici alle sue sinapsi. Tuttavia, i neuroni possono anche essere eccitati da un campo elettrico imposto. In particolare, le recenti applicazioni cliniche attivano i neuroni creando un campo elettrico esternamente. È quindi interessante studiare come il neurone risponda al campo esterno e ciò che provoca il potenziale d'azione. Fortunatamente, un'applicazione precisa e controllata di un campo elettrico esterno è possibile per le cellule neuronali embrionali che vengono escise, dissociate e coltivate in colture. Ciò consente di esaminare queste domande in un sistema altamente riproducibile.

In questo lavoro vengono esaminate alcune delle tecniche utilizzate per l'applicazione controllata del campo elettrico esterno sulle culture neuronali. Le reti possono essere unidimensionali, cioè modellate in linear forme o lasciate crescere su tutto il piano del substrato, e quindi bidimensionale. Inoltre, l'eccitazione può essere creata mediante l'applicazione diretta del campo elettrico tramite elettrodi immersi nel liquido (elettrodi bagno) o inducendo il campo elettrico mediante la creazione remota di impulsi magnetici.

Introduction

L'interazione tra i neuroni e campi elettrici esterni ha implicazioni fondamentali, nonché quelli pratici. Mentre è noto fin dai tempi di Volta che un campo elettrico applicato esternamente può eccitare il tessuto, i meccanismi responsabili per la produzione di un potenziale d'azione risultante in neuroni sono solo di recente iniziando da dipanare ^{1, 2, 3, 4.} Ciò include trovare le risposte alle domande per quanto riguarda il meccanismo che provoca la depolarizzazione del potenziale di membrana, il ruolo di proprietà di membrana e dei canali ionici, e anche la regione nel neurone che risponde al campo elettrico ^{2, 5.} Terapeutico neurostimolazione ^{6, 7, 8, 9,} <supclass = "xref"> 10 metodologie sono particolarmente dipendenti da queste informazioni, che può essere cruciale per il targeting aree colpite e per comprendere l'esito della terapia. Tale comprensione può anche aiutare a sviluppare protocolli di trattamento e nuovi approcci per la stimolazione delle diverse aree del cervello.

Misurare l'interazione all'interno del cervello in vivo aggiunge una componente importante per questa comprensione, ma è ostacolato dalla imprecisione e bassa la controllabilità delle misure all'interno del cranio. Al contrario, le misurazioni in culture possono essere facilmente eseguite in alto volume con alta precisione, eccellente rapporto segnale rumore prestazioni e un elevato grado di riproducibilità e di controllo. Utilizzando colture una grande varietà di proprietà neuronali del comportamento della rete collettiva può essere chiarita ^{11, 12, 13, 14,} </sup> ^{15, 16.} Analogamente, questo sistema ben controllato è prevista essere altamente efficace nel chiarire il meccanismo che altri metodi di stimolazione di lavoro, ad esempio come apertura del canale durante la stimolazione ottico in neuroni optogenetically attive ^{17, 18, 19} è responsabile della creazione potenziale d'azione.

Qui l'attenzione è rivolta che descriva lo sviluppo e la comprensione di strumenti in grado di eccitare in modo efficiente il neurone tramite un campo elettrico esterno. In questo documento si descrive la preparazione di bidimensionale e unidimensionale colture ippocampali fantasia, stimolazione con diverse configurazioni e l'orientamento di un campo elettrico applicato direttamente dagli elettrodi bagno, e infine stimolazione bidimensionale e modellata culture unidimensionali di un variabili nel tempo del campo magnetico, che induce un campo elettrico^{5, 20, 21.}

Protocol

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono la movimentazione degli animali sono stati fatti in accordo con le linee guida del Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) del Weizmann Institute of Science, e la legge israeliana appropriata. Il Weizmann Institute è accreditato dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento del Laboratorio di Animal Care International (AAALAC). Il Comitato Istituzionale Cura ed uso degli animali Weizmann approvato questo studio, condotto con neuroni dell&#39…

Representative Results

Il protocollo presentato permette una facile patterning di colture neuronali. Quando è combinato con vari metodi che abbiamo sviluppato per la stimolazione, permette di effettuare misurazioni di alcune proprietà neuroni intrinseci quali chronaxie e reobase 5, per confrontare le proprietà di neuroni sani e malati 27, per trovare il modo ottimale per stimolare culture come funzione di la loro struttura e molti altri nuovi approcci. A…

Discussion

Il pattern di 1D è uno strumento importante che può essere utilizzato per una varietà di applicazioni. Per esempio, abbiamo utilizzato il modello 1D per la creazione di gate logici da culture neuronali ²⁹ e più recentemente per misurare la Chronaxie e la Rheobase dei neuroni ippocampali ⁵ del ratto e il rallentamento della velocità di propagazione del segnale di attività di cottura nei neuroni ippocampali della sindrome di Down rispetto al Neuroni ippocampali di tipo…

Materials

APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1    1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
FCS(FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4, AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1    1.5.3    1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100X	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1    1.4.1    1.4.2
KCl,  3M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1    2.2    2.3   2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1   3.3   3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4