電気を使用してニューロンと1次元と2次元培養における磁場の外部励起
Summary
神経細胞培養は、単一ニューロンまたはニューロンの人口への影響を通じて新興脳刺激技術を研究するための良いモデルです。ここに提示バス電極によって直接生成または時間変化する磁場によって誘起される電界によりパターニング神経細胞培養物の刺激のための異なる方法があります。
Abstract
その膜電位が一定の閾値を超えた場合、ニューロンは活動電位を発射します。脳の典型的な活動では、これは、シナプスへの化学入力の結果として生じます。しかし、ニューロンも課せられ、電界によって励起することができます。特に、最近の臨床応用には、外部から電場を作成することによって、神経細胞を活性化させます。これは、ニューロンが外部磁場に応答して、何が活動電位が発生する方法を検討することが重要です。幸いなことに、外部電場の正確かつ制御されたアプリケーションは、切除解離、および培養物中で増殖させ、胚性神経細胞のために可能です。これは、再現性の高いシステムではこれらの質問の調査を可能にします。
本論文では、ニューロン培養物に対する外部電界の制御された適用のために使用される技術のいくつかが検討されています。ネットワークは、いずれか1次元、 すなわちリネアにパターニングすることができますR形態または基板の全体面上に成長させ、したがって、二次元。また、励起は、流体中に浸漬電極を介して電界の直接適用（バス電極）または磁気パルスのリモート作成を使用して電場を誘導することによって作成することができます。
Introduction
ニューロンおよび外部電場との相互作用は、基本的な意味合いだけでなく、実用的なものを持っています。それは外部から印加される電界が組織を励起することができるボルタの時代から知られているが、ニューロンにおける結果として得られる活動電位の生成を担うメカニズムは、ごく最近、4 3、2、1解明され始めています。これは、電場2、5に応答ニューロンにおける膜電位の脱分極、膜特性のとイオンチャネルの役割、さらには地域の原因となるメカニズムに関する質問への回答を見つけることが含まれます。治療的神経刺激6、7、8、9、 <supクラス=「外部参照」は> 10個の方法論は、被災地を標的とすると治療の結果を理解するために重要であることができ、この情報に特に依存しています。このような理解はまた、治療プロトコルと、脳内の異なる領域を刺激するための新しいアプローチを開発するのに役立ちます。
in vivoでの脳内の相互作用を測定することは、この理解に重要な要素が追加されますが、頭蓋骨内の測定の不正確さと低制御性によって妨げられています。対照的に、培養物中の測定を容易に高精度、ノイズ性能に優れた信号と再現性と制御性の高い大量に行うことができます。集合的ネットワーク動作のニューロン特性の多種多様を14、13、12、11明らかにすることができる培養物を使用して、 </sup> 15、16。同様に、このよく制御されたシステムは、他の刺激方法がoptogeneticallyアクティブニューロン17、18の光刺激の間のチャネル開口部、19は活動電位を生成するための責任がある方法、例えば、動作するメカニズムを解明するには非常に効率的であることが期待されます。
ここでの焦点は、効率的に外部電界を経由してニューロンを励起することができるツールの開発と理解を記述するにあります。本稿では、バス電極によって異なる構成と直接印加される電界の向きを使用して、刺激を二次元の調製と一次元パターン化された海馬培養物を記述し、そして最終的に二次元の刺激とによって一次元培養をパターニング時間的に変化する電界を誘起する磁界を、5、20、21。
Protocol
倫理文：動物の扱いを含む手順は、ワイツマン科学研究所の所内動物管理使用委員会（IACUC）、および適切なイスラエルの法律のガイドラインに従って行われました。ワイツマン研究所は、実験動物管理・インターナショナルの評価と認定協会（AAALAC）の認定を受けています。ワイツマン制度動物実験委員会は、海馬神経細胞で行ったこの研究を、承認しました。 （2D）2?…
Representative Results
提示プロトコルは、神経細胞培養の容易なパターニングが可能になります。それは私たちが刺激のために開発され、いくつかの方法と組み合わせると、それは、健康と病気のニューロン27の特性を比較するための関数としての文化を刺激するための最適な方法を見つけるために、そのような時値および基電流5のように、いくつ?…
Discussion
1Dパターニングは、様々な用途に使用することができる重要なツールです。例えば、我々は、ラット海馬ニューロン5のクロナキシーおよび基電流を測定するために、より最近ニューロン培養物29からの論理ゲートを作成するための1次元パターニングを使用している、とと比較してダウン症候群海馬ニューロンにおける発火活動の信号伝搬速度の減速します…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、Ofer Feinerman、Fred Wolf、Menahem Segal、Andreas Neef、Eitan Reuvenyに非常に有益な議論に感謝します。著者は、この技術の初期バージョンの開発について、Ilan BreskinとJordi Sorianoに感謝します。作者は理論的概念の助けを借りてTsvi TlustyとJean-Pierre Eckmannに感謝します。この研究は、ミネルバ財団、イスラエル科学技術省、イスラエル科学財団助成金1320/09およびバイナショナル科学財団助成金2008331によって支援された。
Materials
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
| FCS(FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4, AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1 1.5.3 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100X | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 1.4.1 1.4.2 |
| KCl, 3M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 2.2 2.3 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1 3.3 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
- Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
- Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
- Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
- Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
- Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
- Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
- Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, S44-S53 (2009).
- Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
- Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
- Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
- Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
- Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
- Soriano, J., Rodriguez Martinez, ., Tlusty, M., T, E., Moses, Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
- Feinerman, O., Moses, E. A picoliter ‘fountain-pen’ using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
- Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
- Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
- Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
- Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
- Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
- Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).
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Cite This Article
Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).