Externe excitatie van neuronen Met behulp van elektrische en magnetische velden in een-en twee-dimensionale culturen

Summary

Neuronale kweken zijn een goed model voor het bestuderen van de opkomende hersenstimulatie technieken via hun effect op enkele neuronen of een populatie van neuronen. Hier voorgesteld zijn verschillende methoden voor het stimuleren van neuronale kweken patroon door een elektrisch veld rechtstreeks bad elektroden geproduceerd of geïnduceerd door een in de tijd variërend magnetisch veld.

Abstract

Een neuron een actiepotentiaal wordt geactiveerd wanneer de membraanpotentiaal bepaald maximum overschrijdt. In typische activiteit van de hersenen, dit gebeurt als gevolg van de chemische input zijn synapsen. Echter kunnen neuronen ook worden geëxciteerd door een aangebrachte elektrische veld. In het bijzonder de recente klinische toepassingen activeren neuronen door het creëren van een elektrisch veld extern. Het is daarom van belang om te onderzoeken hoe het neuron reageert op het externe veld en wat de oorzaak van de actiepotentiaal. Gelukkig, nauwkeurige en gecontroleerde toepassing van een extern elektrisch veld mogelijk embryonale neuronale cellen die zijn uitgesneden, gedissocieerd en gekweekt in kweken. Dit maakt het onderzoek van deze vragen in een zeer reproduceerbare systeem.

In dit artikel enkele technieken voor gecontroleerde toepassing van extern elektrisch veld op neuronale kweken worden beoordeeld. De netwerken kan zowel eendimensionale, dat wil zeggen een patroon in linear vormen of laat groeien over het gehele vlak van het substraat, en derhalve tweedimensionaal. Voorts kan de excitatie worden door de directe toepassing van elektrische velden via elektroden ondergedompeld in de vloeistof (bad elektroden) of door het induceren van het elektrische veld met de afstandsbediening ontstaan ​​van magnetische pulsen.

Introduction

De interactie tussen neuronen en externe elektrische velden heeft fundamentele implicaties en praktische degenen. Terwijl bekend sinds de tijden van Volta dat een extern aangeboden elektrisch veld weefsel te exciteren, zijn de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de productie van een resulterende actiepotentiaal in neuronen pas onlangs beginnen ontrafeld ^{1, 2, 3, 4.} Dit omvat het beantwoorden van vragen met betrekking tot het mechanisme dat depolarisatie van de membraanpotentiaal, de rol van membraan eigenschappen en ionenkanalen, en zelfs het gebied veroorzaakt bij de neuron dat reageert op het elektrische veld ^{2, 5.} Therapeutische neurostimulatie ^{6, 7, 8, 9,} <sup10 methodologieën zijn in het bijzonder afhankelijk van deze informatie, die van cruciaal belang zijn voor het richten van de getroffen gebieden en het begrijpen van de uitkomst van de therapie. Zo'n begrip kan ook helpen bij het ontwikkelen van behandelingsprotocollen en nieuwe benaderingen voor stimulering van verschillende gebieden in de hersenen.

Het meten van de interactie binnen de in vivo hersenen voegt hierbij een belangrijk onderdeel toe, maar wordt belemmerd door de onnauwkeurigheid en lage controleerbaarheid van metingen in de schedel. Daarentegen kunnen metingen in culturen eenvoudig worden uitgevoerd in hoog volume met hoge precisie, uitstekende signaal-ruisprestaties en een hoge mate van reproduceerbaarheid en controle. Met behulp van culturen kan een grote verscheidenheid aan neuronale eigenschappen van collectief netwerkgedrag worden toegelicht ^{11 , 12 , 13 , 14 ,} </sup> ^{15, 16.} Evenzo is dit goed geregeld systeem verwacht zeer efficiënt bij het ophelderen van het mechanisme waarmee andere stimulatiemethoden werken, bijvoorbeeld hoe kanaalopening bij optische stimulatie optogenetically actieve neuronen ^{17, 18, 19} is verantwoordelijk voor het creëren actiepotentiaal.

Hier ligt de nadruk op het beschrijven van de ontwikkeling en het begrip van de instrumenten die efficiënt de neuron kan prikkelen via een extern elektrisch veld. In dit artikel beschrijven we de bereiding van tweedimensionale en eendimensionale patroon hippocampuskweken, stimulatie met verschillende configuraties en oriëntatie van een direkt elektrisch veld met bad elektroden, en ten slotte stimulering van tweedimensionale en gevormde eendimensionale kweken door een tijd variërend magnetisch veld, die een elektrisch veld induceert^{5 , 20 , 21} .

Protocol

Ethiek Verklaring: Procedures met betrekking tot de behandeling van dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van het Weizmann Institute of Science en de juiste Israëlische wet. Het Weizmann Instituut is geaccrediteerd door de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC). De Weizmann Institutional Animal Care en gebruik Comite deze studie, uitgevoerd met de hippocampus neuronen. <p class="j…

Representative Results

Het gepresenteerde protocol maakt een eenvoudige patroonvorming van neuronale kweken. Wanneer het wordt gecombineerd met een aantal methoden die we ontwikkeld stimulatie, het stelt de metingen van enige intrinsieke neuron eigenschappen zoals Chronaxie en Rheobase 5 maken de eigenschappen van gezonde en zieke neuronen 27 vergelijken optimale manieren om kweken te stimuleren afhankelijk van voorbeeld hun structuur en vele andere nieuwe …

Discussion

1D patroon is een belangrijk instrument dat kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen. Zo hebben we 1D patroonvorming gebruikt voor het maken logische poorten van neuronale kweken ²⁹ en recenter in Chronaxie en Rheobase rat hippocampale neuronen ⁵ gemeten en de vertraging van het signaal voortplantingssnelheid schietbanen activiteit Downsyndroom hippocampale neuronen vergeleken met de wildtype (WT) hippocampale neuronen ^27. De vo…

Materials

APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1    1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
FCS(FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4, AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1    1.5.3    1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100X	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1    1.4.1    1.4.2
KCl,  3M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1    2.2    2.3   2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1   3.3   3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4