Externe Excitation Neurones Utilisation de champs électriques et magnétiques et des cultures dans One- à deux dimensions
Summary
cultures sont un bon Neuronal modèle pour l'étude des techniques nouvelles de stimulation du cerveau par leurs effets sur les neurones individuels ou une population de neurones. Présentés ici sont des méthodes différentes pour la stimulation des cultures de neurones à motifs par un champ électrique produit par des électrodes directement de bain ou induite par un champ magnétique variant dans le temps.
Abstract
Un neurone se déclenche un potentiel d'action lorsque son potentiel de membrane dépasse un certain seuil. Dans l'activité typique du cerveau, cela se produit à la suite d'intrants chimiques à ses synapses. Cependant, les neurones peuvent également être excités par un champ électrique imposé. En particulier, les applications cliniques récentes activent des neurones en créant un champ électrique externe. Il est donc intéressant d'étudier comment le neurone répond au champ extérieur et ce qui cause le potentiel d'action. Heureusement, une application précise et contrôlée d'un champ électrique extérieur est possible pour les cellules neuronales embryonnaires qui sont excisés, dissocié et cultivées dans des cultures. Cela permet à l'enquête sur ces questions dans un système hautement reproductible.
Dans cet article, quelques-unes des techniques utilisées pour l'application contrôlée de champ électrique externe sont passés en revue sur les cultures neuronales. Les réseaux peuvent être soit une dimension, à savoir un motif en lineaR forme ou autorisées à se développer sur tout le plan du substrat, et donc deux dimensions. De plus, l'excitation peut être créé par l'application directe du champ électrique par des électrodes immergées dans le fluide (électrodes de bain) ou en induisant le champ électrique à l'aide de la création à distance d'impulsions magnétiques.
Introduction
L'interaction entre les neurones et les champs électriques externes a des implications fondamentales et des aspects pratiques. Bien qu'il soit connu depuis les temps de Volta qu'un champ électrique appliqué de l'extérieur peut exciter le tissu, les mécanismes responsables de la production d'un potentiel d'action résultant dans les neurones ne commencent qu'à se dévoiler 1 , 2 , 3 , 4 . Cela comprend la recherche de réponses aux questions concernant le mécanisme qui provoque la dépolarisation du potentiel membranaire, le rôle des propriétés membranaires et des canaux ioniques, et même la région dans le neurone qui répond au champ électrique 2 , 5 . Neurostimulation thérapeutique 6 , 7 , 8 , 9 , <supClass = "xref"> 10 méthodologies sont particulièrement dépendantes de cette information, ce qui peut être crucial pour cibler les zones affligées et pour comprendre les résultats de la thérapie. Une telle compréhension peut également aider à développer des protocoles de traitement et de nouvelles approches pour la stimulation de différentes zones dans le cerveau.
La mesure de l'interaction dans le cerveau in vivo ajoute une composante importante à cette compréhension, mais elle est entravée par l'imprécision et la faible maîtrise des mesures au sein du crâne. En revanche, les mesures dans les cultures peuvent être facilement réalisées en volume élevé avec une grande précision, une excellente performance signal à bruit et un degré élevé de reproductibilité et de contrôle. En utilisant des cultures, une grande variété de propriétés neuronales du comportement du réseau collectif peut être élucidée 11 , 12 , 13 , 14 , </sup> 15 , 16 . De même, on s'attend à ce que ce système bien contrôlé soit très efficace pour élucider le mécanisme par lequel d'autres méthodes de stimulation fonctionnent, par exemple, comment l'ouverture de canal pendant la stimulation optique dans les neurones optogénétiquement actifs 17 , 18 , 19 est responsable de créer un potentiel d'action.
Ici, l'accent est mis sur la description du développement et la compréhension des outils qui peuvent exciter efficacement le neurone via un champ électrique externe. Dans cet article, nous décrivons la préparation de cultures hippocampiques bidimensionnelles et unidimensionnelles à motifs, la stimulation utilisant différentes configurations et l'orientation d'un champ électrique directement appliqué par des électrodes de bain et enfin la stimulation de cultures bidimensionnelles et à motifs unidimensionnels par un Champ magnétique variable dans le temps, qui induit un champ électrique5 , 20 , 21 .
Protocol
Representative Results
Discussion
1D motif est un outil important qui peut être utilisé pour une variété d'applications. Par exemple, nous avons utilisé 1D motifs pour créer des portes logiques à partir des cultures de neurones 29 et plus récemment pour mesurer la Chronaxie et Rhéobase des neurones hippocampiques de rat 5, et le ralentissement de la vitesse de propagation du signal d'activité de mise à feu dans les neurones hippocampiques du syndrome de Down par rapport à la type sauvag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef et Eitan Reuveny des discussions très utiles. Les auteurs remercient Ilan Breskin et Jordi Soriano pour développer les premières versions de la technologie. Les auteurs remercient Tsvi Tlusty et Jean-Pierre Eckmann aide les concepts théoriques. Cette recherche a été soutenue par la Fondation Minerva, le Ministère de la Science et de la technologie, Israël et par Israël pour la science subvention 1320-1309 et la science binationale Fondation subvention 2.008.331.
Materials
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
| FCS(FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4, AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1 1.5.3 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100X | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 1.4.1 1.4.2 |
| KCl, 3M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 2.2 2.3 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1 3.3 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
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