Pålitelig og høy effektivitet Utvinning av nyre immunceller
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
Immunsystemet aktivisering skjer i flere nyresykdommer og patofysiologiske prosesser 6,10,11,13. Mulige områder med aktiv forskning omfatter forskjellige triggere for immunsystemaktivering, forskjellige celletyper som er involvert, cytokin / chemokine mønster i en bestemt sykdom innstilling, modulering av alle de nevnte prosesser ved et bestemt legemiddel etc. For å eksemplifisere, etter iskemi-reperfusjon skade (en modell for akutt nyre-skade), er det en økning i immunceller eller benmarg avledet hematopoetiske celler eller CD45 + celler i løpet av noen få timer, som blir opprettholdt gjennom hele perioden for reparasjon eller fibrose (6 uker senere) 5, 12. Disse immunceller utskiller både pro-inflammatorisk og anti-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner å arrangerer prosessen med å reparere 5,12. Foreløpig har muligheten til å bruke flere fluorophores samtidig å merke cellepopulasjoner i en enkelt celle suspensjon økt med annonsenlufte av moderne flowcytometri maskiner med fire til fem lasere. Dette har i det vesentlige lagt til evnen til å diskriminere de cellepopulasjoner basert på deres funksjonelle status 3,7. For eksempel, for å nøyaktig merke en makrofag som F4 / 80 lav CD11b høy Ly6b høy CD206 lav, minst 3 flere fluorophores ville være nødvendig i samme prøvevolumet til gate for levende celler, CD45 + (leukocytter) og Ly6G- (nøytrofiler) og dette er veldig mye mulig med den nyere flowcytometere tre. Imidlertid nedstrøms analyser for cytokinsekresjon, celleproliferasjon, cytotoksisitet, makrofagaktivering og kvantifisering av tall av forskjellige undersett av lymfocytter og monocytter trenger ikke bare god kvalitet (levende celler, singletter), men tilstrekkelig antall celler.
Immunsystemet i nyrene består av både adaptive og medfødte komponenter og flere celletyper 1,7,13. For eksempel, i mus de to kidNEYS sammen er rapportert å inneholde 2-17% (28,000-266,000) CD45 + celler av den totale nyreimmunceller isolert (1,4 x 10 6 celler) og ca 5-15% (1,400-4,200) av disse er CD4 + celler 1 , 5,12. En liten andel (5-15%, 70-630) av disse CD4 + -celler er foxp3 + celler (figur 1) 1. På grunn av disse trinn kloke reduksjoner i prosenter av celler, noen ganger cellepopulasjon av interesse (i dette tilfellet CD45 + CD4 + foxp3 + celler) er representert ved en bare ~ 100 celler. Det lille antall CD45 + CD4 + foxp3 + -celler som gjør det viktig at et stort antall av totale celler isoleres og cellene er av god kvalitet for nedstrøms studier så som cytokin sekresjon analyser. Videre kan det være nødvendig å kombinere nyrer fra 2-3 mus siden subpopulasjoner ikke er representert i høye nok tall til å utføre målbare analyser. Derfor er pålitelig og effektiv isolering av nyre mononukleære cellepopulasjoner ønskelig for å study den immunologiske spektrum assosiert med nyresykdommer.
Tradisjonelt, for isolering av mononukleære celler i nyre, har forskere brukt en rekke enzymatiske spaltninger slik som kollagenase 1A eller II, inkludert DNase en 1,5,12. Det er velkjent at kollagenase har enzymatisk aktivitet som varierer med partinummer og ved selskap i fremstilling, nødvendig titrering for den optimale konsentrasjon og varigheten av inkubasjonen 4,14,15. I tillegg, spaltning med kollagenase gir tid for hakking nyrene i små biter, nødvendiggjør inkubering av nyrestykkene i en oppvarmet (37 ° C) bad og ytterligere tid for inkubering i EDTA for å stoppe reaksjonen. I tillegg kan mindre sterilitet oppnås for noen nedstrøms prosedyrer som trenger cellekultur. Enda viktigere, avhengig av undersøkeren og alle variable som er involvert, fører det til variasjoner i data og tolkning tvers laboratorier. Nylig, med denutvikling av mekaniske vev forstyrrende / homogenisatorer 16, er collagenase fordøyelsen trinnet helt unngås og erstattes av en enkel mekanisk ødeleggelse av nyrene 2. Heri, viser vi en enkel, men effektiv metode for isolering av nyre immunceller for hverdagsimmuncelle ekstraksjon. Viktigere, kan denne teknikken bli tilpasset til andre myke og ikke-fibrøse vev så som lever og hjerne 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presentert her en metode for å oppnå immunceller fra nyrene i en pålitelig og effektiv måte. Den store modifikasjon av den brukte kollagenase fordøyelse trinn (mekanisk ødeleggelse av vev) sparer omtrent 30 minutter og isolering av et stort antall levedyktige immunceller tar under to timer for 4 nyreprøver. Videre, avhengig av vår forskning spørsmål, vi nå bare bruker en enkelt nyre (den andre nyren kan anvendes for proteinanalyse ved Western blots, immunhistokjemi og mRNA-analyse av PCR) for vårt imm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
