Fiable y de alta eficiencia de extracción de riñón de células inmunes
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
Activación del sistema inmune se produce en múltiples enfermedades renales y procesos fisiopatológicos 6,10,11,13. Las posibles áreas de investigación activa abarcan los diversos factores desencadenantes de la activación del sistema inmune, varios tipos de células implicadas, el patrón de citoquinas / quimioquinas en un entorno enfermedad en particular, la modulación de todos los procesos antes mencionados por un medicamento en particular etc. Para ejemplificar, en la isquemia-reperfusión lesión (un modelo para la lesión renal aguda), hay un aumento en las células inmunes o derivadas de médula ósea las células hematopoyéticas o células CD45 + en unas pocas horas, que se mantiene durante todo el período de la reparación o fibrosis (6 semanas después) 5, 12. Estas células inmunes secretan ambas citocinas y quimiocinas proinflamatorias y antiinflamatorias para orquestar el proceso de reparación de 5,12. Actualmente, la capacidad de utilizar múltiples fluoróforos simultáneamente para etiquetar las poblaciones de células en una suspensión de células individuales se ha incrementado con el anuncioventilación de flujo moderna citometría de máquinas con cuatro a cinco láseres. Esto ha añadido sustancialmente a la capacidad de discriminar las poblaciones de células en función de su estado funcional 3,7. Por ejemplo, para etiquetar con precisión un macrófago como F4 / 80 bajo CD11b alto alto CD206 Ly6b baja, sería necesario al menos 3 más fluoróforos en el mismo volumen de muestra a la puerta de células vivas, CD45 + (leucocitos) y Ly6G- (neutrófilos) y esto es muy posible con la nueva citómetros de flujo 3. Sin embargo, los ensayos de aguas abajo para la secreción de citoquinas, la proliferación celular, la citotoxicidad, la activación de macrófagos y la cuantificación de números de varios subconjuntos de linfocitos y monocitos no sólo las necesidades de buena calidad (células vivas, singletes), pero un número adecuado de células.
El sistema inmune en el riñón se compone de dos componentes de adaptación y innatas y múltiples tipos de células 1,7,13. Por ejemplo, en ratones a los dos niñoneys juntos se dice que contiene 2-17% (28,000-266,000) CD45 + células de las células inmunes total de riñón aislado (1,4 x 10 6 células) y alrededor de 5-15% (1,400-4,200) de éstas son las células CD4 + 1 , 5,12. Un pequeño porcentaje (5-15%, 70-630) de estas células CD4 + son FoxP3 + células (Figura 1) 1. Debido a estas reducciones paso prudente en porcentajes de células, a veces la población celular de interés (en este caso CD45 + CD4 + FoxP3 + células) está representada por un simple ~ 100 células. El pequeño número de CD45 + CD4 + células FoxP3 + hace que sea imperativo que un gran número de células totales son aisladas y las células son de buena calidad para los estudios posteriores, como los ensayos de secreción de citoquinas. Por otra parte, puede ser necesario combinar riñones 2-3 ratones ya que las subpoblaciones no están representados en números suficientemente altas para llevar a cabo ensayos cuantificables. Por lo tanto, el aislamiento fiable y eficaz de las poblaciones de células mononucleares de riñón es deseable con el fin de tachonary el espectro inmunológica asociada con enfermedades renales.
Tradicionalmente, para el aislamiento de células mononucleares de riñón, los investigadores han usado una variedad de digestiones enzimáticas tales como la colagenasa 1A o II incluyendo DNasa 1 1,5,12. Es bien sabido que las colagenasas tienen actividad enzimática que varía con los números de lote y por la compañía de fabricación, lo que exige de titulación para la concentración óptima y la duración de la incubación 4,14,15. Además, la digestión con colagenasa añade tiempo para picar el riñón en trozos pequeños, hace necesario la incubación de las piezas de riñón en un baño caliente (37 ° C) y tiempo adicional para la incubación en EDTA para parar la reacción. Además, menos esterilidad puede conseguirse, por algunos de los procedimientos aguas abajo que necesitan cultivo celular. Más importante aún, dependiendo del investigador y todas las variables implicadas, conduce a la variabilidad en los datos y la interpretación a través de los laboratorios. Recientemente, con ladesarrollo de tejido disruptores / homogeneizadores mecánicos 16, la etapa de digestión con colagenasa se evita completamente y reemplazado por un simple rotura mecánica de los riñones 2. En este documento, se demuestra un método simple pero eficiente para el aislamiento de células inmunes del riñón para las extracciones de células inmunes de todos los días. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar a otros tejidos blandos y no fibrosos, tales como el hígado y el cerebro 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos presentado aquí una metodología para obtener células inmunes desde el riñón de una manera fiable y eficiente. La principal modificación en la etapa de digestión de colagenasa ampliamente utilizado (disrupción mecánica de tejido) ahorra aproximadamente 30 min y el aislamiento de un gran número de células inmunes viables toma menos de dos horas para 4 muestras de riñón. Por otra parte, dependiendo de nuestra pregunta de investigación, que ahora sólo se utiliza un único riñón (el otro riñón se pue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
