הפקת יעילות אמינה גבוהה של תאים מכליות חיסון
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
הפעלת מערכת חיסונית מתרחשת מחלות כליה מרובות ותהליכי pathophysiological 6,10,11,13. אזורים מסוכנים של מחקר פעיל להקיף את טריגרים שונים עבור הפעלת המערכת החיסונית, סוגי תאים שונים מעורבים, דפוס ציטוקינים / chemokine באווירה מחלה מסוימת, אפנון של כל התהליכים הנ"ל על ידי תרופה מסוימת וכו 'כדי להדגים, ב-רה-פרפוזיה איסכמיה פציעה (מודל אי-ספיקת כליות חריפה), יש עלייה בתאי המערכת החיסונית או מח עצם שמקורם בתאי hematopoietic או CD45 + תאים בתוך כמה שעות, הנסמך דרך תקופת תיקון או סיסטיק (לימים 6 שבועות) 5, 12. תאים חיסוניים אלו מפרישים הן פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתי ציטוקינים chemokines לתזמר את תהליך תיקון 5,12. נכון לעכשיו, את היכולת להשתמש fluorophores המרובה בו זמנית לתייג אוכלוסיות תאי השעית תא בודדת גדלה עם המודעהפורקן של זרימה המודרנית cytometry מכונה מארבעה עד חמישה לייזרים. זו הוסיפה משמעותית את היכולת להפלות אוכלוסיות תאים בהתבסס על המצב התפקודי שלהם 3,7. לדוגמה, כדי לתייג מקרופאג בצורה מדויקת ככל F4 / 80 נמוך CD11b גבוהה Ly6b גבוהה CD206 נמוך, לפחות עוד 3 fluorophores יהיה צורך במדגם נפח זהה לשער עבור תאים חיים, CD45 + (לויקוציטים) ו Ly6G- (נויטרופילים) ו זה מאוד אפשרי עם cytometers התזרים החדש 3. עם זאת, המבחנים במורד הזרם עבור הפרשת ציטוקינים, התפשטות תאים, cytotoxicity, הפעלת מקרופאג כימות של מספרים של תת השונה של לימפוציטים ומונוציטים לא רק צריכים באיכות טובה (תאי חיים, singlets) אבל מספר הולם של תאים.
המערכת החיסונית בכליות מורכבת משני רכיבים אדפטיבית מולד סוגי תאים מרובים 1,7,13. לדוגמא, בעכברים שני הילדneys יחד מדווח להכיל 2-17% (28,000-266,000) CD45 + תאים של תאי חיסון הכוללות כליות המבודדות (1.4 x 10 6 תאים) וכ 5-15% (1,400-4,200) אלה הם CD4 + תאי 1 , 5,12. אחוז קטן (5-15%, 70-630) של CD4 + אלה התאים FoxP3 + תאים (איור 1) 1. בשל הפחתות החכמות צעד אלה באחוזים של תאים, לפעמים אוכלוסיית עניין התא (במקרה זה CD45 + CD4 + FoxP3 + תאים) מיוצג על ידי גרידא ~ 100 תאים. המספר הקטן של CD45 + CD4 + FoxP3 + תאים עושה את זה הכרחי כי מספר גדול של תאים הכוללים מבודדים התאים הם באיכות טובה ללימודים במורד כגון מבחני הפרשת ציטוקינים. יתר על כן, ייתכן שיהיה צורך לשלב כליות מעכברים 2-3 מאז subpopulations אינם מיוצגים במספרים גבוהים מספיק כדי לבצע מבחנים לכימות. לפיכך, בידוד אמין ויעיל של אוכלוסיות תאים mononuclear כליות רצוי כדי הרבעהy הספקטרום אימונולוגיים הקשורים למחלות כליה.
באופן מסורתי, לבידוד תרמי של תאים mononuclear בכליות, החוקרים השתמשו במגוון של digestions האנזימטית כגון collagenase 1A או II כולל DNase 1 1,5,12. עובדה ידועה היא כי יש collagenases הפעילות האנזימטית משתנה עם הרבה מספרים ועל ידי חברה של ייצור, דבר המחייב טיטרציה עבור הריכוז האופטימלי ומשך הדגירה 4,14,15. בנוסף, מערכת העיכול עם collagenase מוסיף זמן וקוצצים את הכליה לחתיכות קטנות, מחייבת הדגירה של חתיכות כליות באמבט מחוממת (37 מעלות צלזיוס) ואת זמן נוסף הדגירה EDTA להפסקת התגובה. בנוסף, פחות סטריליות עשויים להיות מושגת על כמה נהלים במורד צורך תרבית תאים. יתרה מכך, בהתאם החוקר וכל המשתנים המעורבים, זה מוביל השתנות נתונים ופרשנות על פני מעבדות. לאחרונה, עםפיתוח משבשי רקמה המכאני / homogenizers 16, צעד עיכול collagenase הוא נמנע לחלוטין ובמקומו הפרעה מכאנית פשוטה של הכליות 2. בזאת, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה אך יעילה עבור הבידוד של תאים חיסוניים כלית עקירות תא חיסון היומיום. חשוב לציין, טכניקה זו ניתן להתאים רקמות רכות והלא-סיביות אחרות כגון כבד ומוח 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצגנו כאן מתודולוגיה להשיג תאים חיסוניים מהכליה באופן אמין ויעיל. השינוי המרכזי לשלב עיכול collagenase בשימוש הנרחב (הפרעה מכאנית של רקמה) חוסך כ -30 דקות והבידוד של מספר רב של תאי קיימא חיסוניים לוקח פחות משעות עבור 4 דגימות כליות. יתר על כן, בהתאם שאלת המחקר שלנו, אנחנו עכשי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
