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Developmental Biology

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Published: December 16, 2016 doi: 10.3791/54372
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3, 1,3,5, 1,3
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Introduction

Hämatopoese ist ein komplexer Prozess , bei dem Entwicklungs hämatopoetischer Stammzellen (HSZ) vorhanden hemogenic Endothel abgeschnürt in einer Vielzahl von embryonalen hämatopoetischen Stätten wie die Aorta-Gonad-Mesonephros und der Plazenta 1,2. Die Unfähigkeit zur Kultur HSCs in vitro verhindert , dass die eingehende Analyse dieses Prozesses sowie die klinische Anwendung dieser Studien. Zur Umgehung dieser Einschränkung, frühere Studien haben versucht abzuleiten HSZ de novo entweder über die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (PSCs) 3, oder induzierte Plastizität in somatischen Zellen und gerichtete Differenzierung mit Neuprogrammierung Medien 4,5. Diese Studien jedoch erzeugen keine klinisch sicher engraftable Zellen oder erlauben Studie der endgültigen Entwicklung Hämatopoese "in einer Schale."

Das neue Werk von Yamanaka etabliert und Kollegen pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) aus somatischen Fibroblasten p induziert zu erzeugen,rovides einen Rahmen für die Transkriptionsfaktor (TF) basierend Überexpression Strategien in Reprogrammierung des Zellschicksals 6,7. Diese Arbeit hat aufgefordert, die Ermittler in mehreren Bereichen Zelltypen der Wahl über TF Reprogrammierung von leicht zugänglichen somatischen Zellen zu erzeugen. Das Ziel der hier beschriebenen Umprogrammierung Strategie ist eine hemogenic Prozess von Maus somatischen Zellen zu induzieren , unter Verwendung eines TF basierend Umprogrammierung Ansatz mit dem Ziel , diese Erkenntnisse auf das menschliche System des Übersetzens patientenspezifischen Fibroblasten um umprogrammieren humanen Hämatopoese in vitro zu studieren und erzeugen patientenspezifische Blutprodukte für Krankheitsmodelle, Drogentests und Stammzelltransplantation.

Der erste Schritt richtige Umprogrammierung in diesem Maus-System, um sicherzustellen, war ein Reporter Linie zu entwickeln, die als Auslese für CD34-Expression, ein bekannter Marker in endothelialen Vorläuferzellen und HSZ serviert. Dazu wurden die huCD34-tTA und TetO-H2BGFP transgene Mauslinien verwendet, um generate doppelt transgenen embryonalen Maus - Fibroblasten (MEF), bezeichnet nun 34 / H2BGFP, die 8 bei Aktivierung des CD34 - Promotors grün fluoreszieren. Dies erlaubt Screenen einer Vielzahl von TFs bekannt an verschiedenen Punkten während des hämatopoetischen Spezifikation und Entwicklung benötigt werden. Beginnend mit 18 TFs in pMX retrovial Vektoren (bestimmt durch die Literatur Bergbau und Profilierung von GFP etikettenhalt HSZ aus dem zuvor 34 beschrieben / H2BGFP Mäuse), 34 / H2BGFP MEFs wurden transduziert mit allen Faktoren und kultiviert auf AFT024 HSC tragende Stromazellen. Nach der Erkennung von 34 / H2BGFP Aktivierung wurde identifiziert TFs wurden anschließend von der Umprogrammierung Cocktail bis die optimale Menge von TFs für Reporter Aktivierung entfernt. Nach diesem ersten Bildschirm wurden die Faktoren, die zu einem DOX induzierbaren pFUW Vektorsystem übertragen steuerbaren Expression der TFs zu ermöglichen. Da diese beiden DOX steuerbare Systeme inkompatibel sind (die 34 / H2BGFP Zellen und die pFUW induzierbarer Vektoren), MEFs ausWildtyp C57BL / 6-Mäuse wurden erforderlich. Es war auch notwendig, eine geeignete Mikroumgebung zur Verfügung zu stellen hemogenesis fortzufahren und schaffen multilineage clonogene Vorläufern zu ermöglichen.

Aktuelle Studien somatischen Zellen in hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) haben vielfältige Erfolgsstufen 9-11 erfüllt umprogrammieren versuchen. Bis heute ist die Erzeugung von Maus und Mensch transplantierbaren HSPCs mit langfristigen und sich selbst erneuernde repopulating Fähigkeit wurde mit dem gleichen Satz von TFs nicht erreicht. In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Beschreibung der zuvor festgelegten Strategie zu reproduzierbar hemogenesis MEFs induzieren. Wir zeigen , dass die Einführung eines minimalen Satz von TFs (GATA2, Gfi1b, cFos und ETV6) ist in der Lage ein komplexes Entwicklungsprogramm in vitro angestiftet , die eine Plattform kann weiter durch die Entwicklung der Hämatopoese und klinische Anwendung von hämatopoetischen Neuprogrammierung bietet 12 untersucht werden.

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Protocol

Ethik-Anweisung: Maus-Zelllinien sind im Anschluss an die Tierpflege Richtlinien der Icahn School of Medicine am Berg Sinai abgeleitet und sollte in Übereinstimmung mit jedem Host Institution durchgeführt werden.

1. Maus embryonale Fibroblasten (MEF) Isolierung von C57BL / 6-Mäuse

  1. Richten Sie timed Paarung 13. Sobald ein Vaginalpfropfens sichtbar ist, sollten Sie diesen Tag 0,5.
  2. Trennen Sie die angeschlossen Weibchen am Stecker Datum und überprüfen sie auf Tag 10-11 Schwangerschaft zu bestätigen.
  3. Am Tag 13,5-14,5 schwangere weibliche Mäuse über CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte einschläfern.
  4. Tränken Sie schwangere Frau Bauch mit 70% Ethanol, sezieren die Bauchhöhle mit einer sterilen Schere und Pinzette auf der Mittellinie, und operativ entfernen die Gebärmutterhörner mit den 14 Embryonen. Nehmen Sie die Embryonen vorsichtig aus, während die restlichen Bauchgewebe abzuschneiden.
    HINWEIS: Wiederherstellen etwa 8 Embryonen mit 4 auf jeder Seite.
  5. Legen Sie die Gebärmutter-hORNs die Embryonen in einer 10 cm-Schale mit 5-10 ml steriler gekühlter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) enthält.
  6. Mit einer sterilen Schere und Pinzette, machen einen Einschnitt entlang der Gebärmutterhörner die Säcke zu isolieren, um die Embryonen tragen. Übertragen Sie die Säcke zu einem neuen 10-cm-Schale mit 5-10 ml sterilem PBS gekühlt und auf Eis.
  7. Legen Sie ein paar der Säcke in eine neue 10 cm-Schale mit 5-10 ml sterilem PBS gekühlt. Mit einer sterilen Schere und Pinzette vorsichtig die Säcke aufgeschnitten (ohne zu tief schneiden), um die Embryonen zu vermeiden, Piercing.
  8. Trennen Sie die Embryonen aus der Plazenta durch die Nabelschnur zu schneiden.
  9. Übertragen Sie die Embryonen auf eine neue 10 cm-Schale mit 5-10 ml gekühlter PBS und verlassen auf dem Eis, während die restlichen Dissektionen Abschluss.
  10. Enthaupten die Embryonen mit einer sterilen Pinzette. Schneiden Sie vorsichtig die Mittellinie des Embryos mit einer sterilen Schere und Pinzette nach unten, von der enthaupteten Bereich Starten des Bauches zu öffnen. Position Zange unterhalb ter inneren Organe (einschließlich des Herzens, der Leber und Lunge) und kratzen sie 15 aus.
  11. Schneiden Sie das verbleibende Gewebe in kleine Stücke mit einer Schere und Pinzette und in ein 50 ml konischen Röhrchen mit 10 ml Trypsin.
  12. Pipettieren nach oben und unten mit einer 10-ml-Pipette 20-30 mal das Gewebe zu mischen und trennen.
  13. Inkubieren des Gewebes und Trypsin Mischung in einem 37 ° C Wasserbad für 45 min, wirbelnde gelegentlich.
  14. Pipettieren nach oben und unten mit einer 10-ml-Pipette für etwa 5 Minuten um den Inhalt zu mischen.
  15. Hinzufügen trypsiniert Zellen Volumen Standard Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) zu 3x, 10 ug / ml Penicillin / Streptomycin (P / S), und 1 mM L-Glutamin (L-GLUT) in 10-cm-Schalen (~ 10 ml) und die Kultur bei 37 ° C bis zur Konfluenz (ca. 2-4 Tage). Kultur etwa 1-2 Embryonen pro 10 cm Schale.
    HINWEIS: Freeze-Zellen einmal Platten konfluent sind. Gefrorene Zellen können aufgetaut werden und agierten 2 weitere Male. Die Zellen können alternativgeteilt 2 mal vor dem Einfrieren, und dann noch einmal nach dem Auftauen.

2. virale Produktion

  1. 293T-Zellen in 10 cm-Platten mit 10 ml DMEM mit 10% FBS erweitern, 1% P / S und 1% L-GLUT zur Transfektion.
    1. Trypsinize 293T-Zellen mit 2 ml Trypsin, für 5 min bei 37 ° C inkubieren, sammeln die Zellen in 15-ml-Röhrchen, Schleudern bei 300 g, und die Platte in geeigneter Weise (10 ml pro 10 cm Schale).
  2. 24 Stunden vor der Transfektion aufgeteilt konfluenten 10 cm-Platte von 293T-Zellen 1: 6 und Samen in 10 cm Gelatine (0,1% Gelatine in PBS) Platten.
    HINWEIS: 4 Platten pro Virus benötigt werden.
    1. Zu beschichten Platten in Gelatine, fügen mindestens 2 ml der 0,1% igen Gelatinelösung zu beschichten, die Unterseite 10 cm-Platten. bei 37 ° C inkubieren mindestens 20 min. Absaugen Gelatine vor der Zellen auf die Platten hinzufügen.
  3. In einem 15-ml-Röhrchen, fügen Sie 84 ug Plasmid (zB GATA2, Gfi1b, cFos oder ETV6 (subkloniert in die pFUW-TetO vectoder 16) oder FUW-M2rtTA 17), 84 & mgr; g psPAX2, und 42 & mgr; g pMD2.G. Wasser (H 2 O) , um das Volumen auf 2 ml zu begrenzen . Bereiten Sie eine Röhre für jeden Faktor (zB. GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 und FUW-M2rtTA).
  4. Nach Eintragen von 250 ul 2 M CaCl 2 in jedes Röhrchen 2 ml der Mischung aus 84 & mgr; g des ausgewählten Gen enthält (GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 oder FUW-M2rtTA) + 84 & mgr; g psPAX2 + 42 & mgr; g pMD2.G + H 2 O .
  5. Mit Hilfe einer Pasteur - Pipette der Pipettierhilfen eingefügt in, Blasen Freisetzung in die 2,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 - Gemisch. Da die Blasen mit der Spitze eines P1000 gegen die Glaspipette wird erzeugt werden, legen und langsam auszuwerfen 2 ml 100 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethansulfonsäure (BES), Kochsalzlösung auf der Pasteur-Pipette 1 ml auf einmal.
  6. Inkubieren alle Rohre in der Kulturhaube bei Raumtemperatur für mindestens 15 min.
    HINWEIS: Die 4,25 ml Mischung (jetzt DNA + H 2 O + 2M CaCl 2
  7. Wenn die Mischung brütet, absaugen Medien aus 293T-Platten und 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-Glutamin + 25 nM Chloroquin hinzufügen.
    HINWEIS: Diese Medien nicht P / S enthalten.
  8. Nach mindestens 15 min Inkubation (oder bis Medien auf 293T - Zellen zu verändern), fügen Sie die 4,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES Salzmischung fallen weise auf die 293T - Zellen pro Röhrchen gleichmäßig über 4 Zellenplatten verteilen (also etwas mehr als 1 ml des Gemisches pro Platte).
  9. Inkubieren Platten über Nacht (O / N) bei 37 ° C.
  10. 24 Stunden nach der Inkubation ersetzen Medien auf allen Platten mit 4 ml Standard DMEM (siehe Schritt 1.15).
  11. Halten Zellen in einem 32 ° C Inkubator von nun an.
  12. 24 Stunden nach dem Schritt 2.10, sammeln Medien in separate 50-ml-Röhrchen. Ersetzen Sie die gesammelten Medien von jeder Platte mit 4 ml Standard DMEM.
    HINWEIS: 4 Platten pro anfänglichen Rohr Mischung Ergebnisse in 16 ml gesammelt Medien.
    1. EINN ach 12 h Inkubation sammeln Medien wieder in die gleichen 50-ml-Röhrchen und ersetzen mit weiteren 4 ml Standard DMEM.
    2. Nach 12 h Inkubation, die Medien zu sammeln und zu den gleichen 50-ml-Röhrchen hinzufügen.
      HINWEIS: jedes Rohr sollte nun enthalten etwa 48 ml Medium, das Virus.
  13. das gesammelte Virus, erste Filter die gesammelten Medien durch 0,45 & mgr; M Low-Protein-Bindung Filter zu konzentrieren.
  14. Gießen die gefilterten Medien mit Virus in virale Konzentration Zentrifugenröhrchen (ca. 16 ml auf einmal).
  15. Spin bei 4.000 × g bei 4 ° C für 25 min und Durchfluss entfernen.
    HINWEIS: Ein kleines Volumen konzentrierter Medien und Virus wird in den Filter sichtbar.
  16. Fügen Sie weitere 16 ml der gefilterten virushaltigen Medien zu dem konzentrierten Medien + Virus Volumen im Filter verbleibende und mischen durch das Rohr zu invertieren.
  17. Spinnrohr wieder bei 4.000 × g bei 4 ° C für 25 min und Durchfluss verwerfen.
  18. Die restlichen gefiltertSammlung der konzentrierten Medien + Virus Volumen links im Filter und mischen durch den Schlauch zu invertieren.
  19. Spin erneut bei 4.000 × g bei 4 ° C für 10-20 min (abhängig von dem Volumen in dem Filter) und sicherzustellen, dass das verbleibende Volumen von konzentriertem Medium + Virus in dem Filter nach links beträgt etwa 1 ml. Wenn mehr als 1 ml konzentrierter Medien + Virus im Filter bleibt, drehen wieder bei 4.000 × g für 1 min und wiederholen, bis 1 ml im Filter verbleibt.
  20. Aliquot 200 ul des konzentrierten Virus in 1,5-ml-Röhrchen und Einfrieren bei -80 ° C oder sofort ab.

3. MEF Reprogrammierung

  1. Pre-Mantel 6 Well-Platten mit 0,5 ml 0,1% Gelatine in PBS pro Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Gelatine den gesamten Bereich des Bohrlochs erstreckt. Legen Sie in einem 37 ° C Inkubator und Inkubation für mindestens 20 min. Nach der Inkubation der Platten zu entfernen und die Gelatine absaugen.
  2. Platte MEFs mit Standard DMEM mit einer Dichte von 25.000 Zellen pro Vertiefung (150.000 Zellenpro 6-Well-Platte) auf der gelierten 6-Well-Platte (n) aus Schritt 3.1 und ermöglichen O / N in einem 37 ° C Inkubator absetzen.
  3. Bereiten Sie eine 100 ul-Virus-Cocktail durch Mischen von 50 & mgr; l M2rtTA und die restlichen 50 ul einer Mischung aus GATA2, Gfi1b, cFos und ETV6 (12,5 ul jeweils).
  4. Absaugen Medien von MEFs und 2 mL Standard DMEM mit 8 ug / ml Hexadimethrinbromid.
  5. O / N bei 37 ° C transduzieren jede Vertiefung der MEF-Platten mit 15 ul des Cocktail-Virus und brüten.
    Hinweis: Dies ist Tag 0 der Reprogrammierung.
  6. Am Tag 1 nach 16-20 h Inkubation ersetzen Medien mit 2 ml frischem Standard DMEM mit 1 ug ergänzt / ml DOX pro Vertiefung.
  7. Bereiten hämatopoetischen Kulturmedien mit Hydrocortison supplementiert (10 -6 M), 100 ng / mL Stammzellfaktor (SCF), 100 ng / ml Fms-verwandte Tyrosinkinase 3 - Ligand (Flt3L), 20 ng / ml Interleukin-3 (IL- 3) 20 ng / ml Interleukin-6 (IL-6) und 1 & mgr; g / ml DOX.
  8. Am Tag 4 aspirate Medien aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS pro Vertiefung.
  9. Absaugen PBS distanzieren Zellen unter Verwendung von 1 ml 0,05% Trypsin pro Vertiefung und die Zellen zu sammeln.
  10. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer, Spin bei 300 g für 5 min, Resuspension in 12 ml hämatopoetischen Medien in Schritt 3.7 beschriebenen und Platte 60.000 Zellen pro 6-Well-Platte auf 0,1% Gelatine beschichtete Platten (2 ml pro Vertiefung, 10.000 Zellen pro Vertiefung ).
  11. Ersetzen Medien mit frischen hämatopoetischen supplementierten Nährböden alle 6 Tage für die Dauer der Kultur (35-36 Tage).
  12. Analysieren Sie entweder Zwischenzellen oder Schwellen hämatopoetischen-ähnlichen Zellen über Immunfärbung 12, FACS - Analyse 8,12, qRT-PCR 12 und mRNA - Sequenzierung 12 den Erwerb von hemogenic endothelialen oder HSC-ähnliche Markierungen und die Genexpression zu bestätigen.

4. Plazentare Aggregation und koloniebildende Einheit (CFU) Assays in Methylcellulose

  1. Präparieren Plazenten von schwangeren C57BL / 6 - Mäuse wie zuvor beschrieben 18 bei E12,5 und halten Gewebe auf Eis.
  2. Um 19 Plazenta Dissoziation beginnen, waschen Plazentagewebe in 2-5 ml 0,2% Kollagenase Typ I in PBS mit 20% FBS und mechanisch mit einer 18G Nadel distanziere durch Passagierung die Plazenta und PBS durch die Nadel einer 5 - ml - Spritze angebracht in mindestens dreimal.
  3. Nach der mechanischen Dissoziation, halten für 1,5 Std Plazentazellen in 2-5 ml Kollagenase-Lösung bei 37 ° C.
  4. Passage-Zellen durch 20-25 G Nadeln auf 5 ml Spritzen mehrmals angebracht weiter distanzieren mechanisch die Plazentazellen.
  5. Filter Einzelzellsuspensionen durch 70 um Zellsiebe.
  6. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und bestrahlen bei 2.000 cGy für mitotische Inaktivierung 20.
  7. 10 ml hämatopoetischen Nährmedien mit 100 ng / ml SCF ergänzt, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, und 10 ng / ml Thrombopoietin (TPO) auf eine 10 cm Gericht.
    HINWEIS: DOX ist in diesem Stadium nicht erforderlich.
  8. Legen Sie ein 0,65-um-Filter direkt auf das hämatopoetische Kulturmedien in der Schale, so dass sie zu schweben ein Flüssigkeits-Gas-Schnittstelle zu schaffen und die Schale beiseite stellen.
  9. Dissoziieren Tag 25 transduziert MEFs (abgeleitet von Schritt 3.11) als 3,8 bis 3,10 in den Schritten und mit 167.000 Zellen der Plazenta-Aggregate aus Schritt 4.6 33.000 der transduzierten MEFs mischen (1: 6-Verhältnis).
  10. Ein Aggregat 18,21, erste Spin - Down der MEF und Plazenta - Zellmischung aus Schritt 4.9 für 5 Minuten bei 300 x g zu erzeugen. Absaugen Medien und Resuspendieren der pelletierten Zellen in 30-50 ul Standard DMEM eine P200-Pipette, die Einzelzellsuspension in die 200 ul nonbevelled Pipettenspitze zu ziehen.
  11. Verschließen Sie die Pipettenspitze mit Paraffinfilm. Legen Sie die blockierten Spitze in einen 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Spin-down für 5 Minuten bei 300 g so ein Pellet bildet sich an der überdachten Ende der Spitze.
  12. Die Spitze aus dem 15-ml-Röhrchen sorgfältig und Ortdie Spitze auf das Ende der P200 Pipette. Entsorgen Sie die Paraffinfilm und extrudieren des Zellpellets auf das Floating-Filter aus Schritt 4.8.
    HINWEIS: Platte höchstens 3 Aggregate pro Filter.
  13. Kultur die Aggregate auf den schwebenden 0,65 um Filter für 4-5 Tage in 37 ° C mit 5% CO 2.
  14. Sammle die Aggregate (höchstens 3 pro Filter) mit einem Zellschaber, kombiniert sie und Verdau mit 0,2% Kollagenase, nach dem gleichen Protokoll wie bei den ganzen Plazenten getan, um die Zellen dissoziiert (Schritte 4,2-4,5).
  15. Nach Dissoziation, waschen Sie die Aggregate mit 2-5 ml PBS mit 5% FBS und Zellen bei 300 g für 5 min Spin-Down.
  16. Resuspendieren der Aggregate in 500 & mgr; l DMEM ohne FBS, P / S, oder L-GLUT. Nehmen Sie das 500 & mgr; l Aufwirbelung und fügen Sie ihn in 3 ml 1% Methyl Medien, ergänzt mit 10 / ml TPO ng, sorgfältig die Bildung von Blasen zu vermeiden. Platte gleichen Volumen dieser Mischung in 3 35 x 10 mm nicht behandelte Kulturschalen fürCFU - Assays 12.
  17. Als Kontrolle wurden bestrahlte Kultur plazentalen Aggregate ohne 4-5 Tage in umprogrammiert MEFs Mischen und in CFU-Assays wie oben 4,7-4,16 in Schritten beschrieben.
    HINWEIS: Diese Aggregate allein keine Kolonien bilden.
  18. Zählen hämatopoetische Kolonien manuell unter dem Mikroskop nach 10-14 Tagen Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  19. Cytospin 22 nahm Kolonien morphologischen Phänotyps von einzelnen Zellen zu zeigen.

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Representative Results

Hämatopoese ist ein komplexer Entwicklungsprozess, in verschiedenen embryonalen Standorten beginnt. Hemogenic Endothelzellen befinden sich in diesen Seiten und führen zu HSZ über Zelle 23 Knospung. Dieser Prozess derzeit nicht durch das Platzieren HSZ oder hämatopoetische Vorläufer in Kultur reproduziert werden, wobei eine Methode erforderlich , diese Zellen in vitro , um irgendwie zu erhalten, entweder durch HSPC Expansion ex vivo oder Generation de novo. Dieses Protokoll zeigt unsere neuartige Technologie, die diese Zellen über TF-Überexpression in MEF zu erhalten versucht.

Abbildung 1 zeigt die Gesamt Umprogrammierung. Nach MEF Erzeugung und Expansion werden die Zellen mit GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 und FUW-M2rtTA transduziert. Nach 3 Tagen der Expansion und der Exposition gegenüber DOX Transgen Aktivierung zu beginnen, werden die Zellen dissoziiert und Split an Tag 4 auf mit Gelatine beschichtete Platten undin ergänztem hämatopoetischen Medien gezüchtet.

Nach längerer Kultur Postübertragung mit der Neuprogrammierung Medien, nehmen Zellen klare morphologische Veränderungen. Am Tag 20 Zellen annehmen endotheliale Morphologie unterscheidet sich von MEFs. Weitere Kultur zu Tag 35 führt zu mehreren runden hämatopoetischen-ähnliche Zellen aus den Endothel-ähnlichen Zwischenschwellen , die GFP sind + und Flecken positiv für die hämatopoetischen Marker Sca1 und CD45 (Abbildung 2) (bei Verwendung der 34 / H2BGFP MEFs verwenden). Diese Färbung zeigt, dass diese Zellen phänotypische Marker andeutend hemogenic Induktion gewinnen. Weitere Kultur führt in Zellen CD45 exprimieren, während die Expression des Reporter huCD34 beibehalten wird. Bei der Plazenta Aggregation Kulturzellen clonogene Potential annehmen und Kolonien in Methylcellulose mit verschiedenen hämatopoetischen Morphologien und Explosion-ähnliche Zellen (Abbildung 3) zu erzeugen.

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Abbildung 1: Strategie für hemogenic Induktion in MEFs. Schematische Darstellung der Umprogrammierung und jeden Schritt innerhalb dieser Gruppe. Die allgemeine Umprogrammierung Verfahren beinhaltet zuerst MEF Expansion, durch Spaltung an der geeigneten Dichte in Gelatine-beschichteten 6-Well-Platten verfolgt. Die Zellen werden dann mit dem Cocktail aus GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 und FUW-M2rtTA transduziert. Die Zellen werden weiter kultiviert mit Standard-DMEM mit DOX ergänzt. Am Tag 4-Zellen werden mit Trypsin behandelt und aufgeteilt in 6-Well-Platten. Alle 6 Tage Medien verändert und an ausgewählten Zeitpunkten Zellen durch FACS, CFU, oder Genexpressionsassays analysiert werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Die Induktion von hämatopoetischen Zellen aus Vorstufen entstehen. Zellen, die positiv für 34 / H2BGFP gefärbt Sca1 und CD45 zeigen Induktion eines hemogenic Programm. (A) Dieses Bild zeigt eine Zusammenführung von Zellen gefärbt für CD45 und Sca1 während GFP fluoresziert mit einem zugrunde liegenden Hell- Bild der umprogrammiert Zellen. Nur ein Teil der flachen Zellpopulation drückt Sca1, eine endotheliale / hemogenic Marker und gerundet nur Blut-ähnliche Zellen aus diesen Zellen für CD45, ein pan-hämatopoetischen Marker Fleck rot entstehen. (B) Dieses Bild zeigt die gefärbten und GFP fluoreszierenden Zellen ohne das Hell- Bild, klar enge Verbindung von CD45 + Zellen mit dem Sca1 + Zellen zeigt. Maßstabsbalken = 100 & mgr; M. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 3: Erzeugung von CD45 + hämatopoetischen Zellen. (A) Über 12,7% der 34 / H2BGFP MEFs transduziert mit GATA2, Gfi1b, cFos und ETV6 sind GFP + CD45 + nach 35 Tagen der Reprogrammierung. Klar myeloische Morphologien und Explosion-ähnliche Zellen können nach H & E - Färbung (B) nach Cytospin von CD45 + sortierten Zellen plattiert in Methylcellulose für 10-14 Tage zu sehen. Dies zeigt die klonalen multilineage Potential der umprogrammiert Zellen, die hämatopoetische Funktion nach Transduktion mit diesem minimalen Satz von TFs nehmen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; M. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Erzeugen HSPCs de novo aus leicht erreichbar somatischen Zellen bietet eine einzigartige Methode der Hämatopoese in vitro zu untersuchen und die Möglichkeit, potentiell diese Technologie auf das menschliche System anzuwenden. Diese Übersetzung würde ein neues Werkzeug zu studieren menschliche hämatologische Erkrankung in einer Schale zu erzeugen, sowie Drogentestplattformen und Gen-Targeting-Möglichkeiten bieten zu zahlreichen Erkrankungen mit neuartiger Therapeutika oder HSC-Transplantationen behandeln. Auf dem Gebiet haben neuere Studien über die Fähigkeit erweitert HSPCs de novo, demonstrieren die Bedeutung der verschiedenen Merkmale der Umprogrammierung zu erzeugen. Dazu gehören die Wahl der Ausgangszellpopulationen und TF Cocktails, sowie wie Kulturbedingungen (Co-Kultur - Nische) und Ergänzung (Zytokine, kleine Moleküle, etc.) signifikant die Effizienz Auswirkungen von 24-26 Neuprogrammierung. Mehrere Studien Umprogrammierung Technologie für das menschliche System anwenden, ohne sich durch Reiseneine pluripotente Zwischen, 27,28 ein unerwünschter Schritt in diesen Prozessen.

Hier ist ein Protokoll, das die erste zu erzeugen, HSC-ähnliche Zellen aus somatischen Zellen über einen Entwicklungsprozeß wurde, während die Verwendung der Pluripotenz Faktoren zu vermeiden und die Bildung von pluripotenten Zwischenprodukte. Die erzeugten HSC-ähnlichen Zellen erscheinen über einen Entwicklungsprozess zu entwickeln, erste Zellen erfordern ein hemogenic endothelialen Zwischen ähnlich einer EHT zu reisen. Am Tag 20 der Reprogrammierung Endothel-ähnlichen Zwischenform, die endotheliale und hämatopoetische Genexpressionsprofile enthalten. HSC-ähnliche Zellen entstehen aus diesen Zwischenzellen an Tag 35 die Zelloberfläche Immuno-Phänotypen und Genexpressionsprofile sehr ähnlich wie HSZ enthalten und roten und weißen Kolonien in CFU-Assays produzieren kann. Dies deutet darauf hin , dass, im Gegensatz zu den meisten anderen Studien dieser Umprogrammierung Protokoll eines komplexen Entwicklungsprozess in vitro rekapituliert und kann Dauerwellees weitere Untersuchung der Hämatopoese und hämatologische Krankheitsprozesse, die embryonalen Hämatopoese beteiligt. Diese Studien ermöglichen die weitere Forschung auf, wie die Vielzahl von hämatologischen Erkrankungen zu behandeln und zu heilen, die es gibt, und wie die Hämatopoese zu diesem Zweck zu manipulieren. Dies kann durch Induzieren eines hemogenic Programm in patientenspezifischen Fibroblasten durchgeführt werden in vitro Krankheitsmodelle herzustellen. Mit diesen Modellen normalen und erkrankten Hämatopoese fein seziert und untersucht werden können, sowie unterzogen, um Drogen-Bildschirme und Gen-Bearbeitung zu behandeln / korrekte hämatopoetischen mit der Krankheit von Interesse assoziiert Mängel.

Maus-Fibroblasten unterstützt die verschiedenen nützlichen Eigenschaften dieser Umprogrammierung. Die Fibroblasten selbst sind leicht von Spendermäusen zu erhalten, Zell Erwerb unkompliziert. also nur Patienten Hautproben erforderlich machen würde, diese Technologie auf den Menschen zu übersetzen, so dass Erwerb von patientenspezifischen Blutprodukte und nachfolgende Zelle teStachel eine praktikable Option für hämatologische Behandlung von Krankheiten. Zusätzlich sind Fibroblasten sehr epigenetically verschieden von hämatopoetischen Zellen, in diesem Protokoll Umprogrammierung sowohl epigenetically repress Fibroblasten - Identität , die Fähigkeit der ausgewählten TFs demonstriert, und auch durch Ändern der epigenetischen Speicher der Ausgangszellen 29,30 ein hemogenic Programm zu veranlassen . Obwohl die Transplantationsstudien zeigen, noch nicht voll multilineage Verpflanzung Funktion dieser abgeleiteten Zellen zu sehen, wenn diese Faktoren ein hemogenic Programm induzieren, die von großem Interesse sein wird, voll funktionsfähige hämatopoetische Zellen im menschlichen System erzeugt.

Mehrere Schritte in diesem Protokoll kann während der Umprogrammierung, wie die Anzahl von Zellen plattiert vor der Transduktion und der Menge des Virus verwendet zur Transduktion bei Schwierigkeiten modifiziert werden. Optimale Ergebnisse wurden mit 150.000 Zellen gesehen pro 6-Well-Platte (Schritt 3.2) mit dem zuvor beschriebenen Volumen von virus (Schritte 3.3 und 3.5), aber mehr Zellen mit dem Virus bei Zelltod bei Belichtung verwendet werden. In ähnlicher Weise können kleinere Mengen des Virus verwendet werden soll Zelltod ein Problem sein, solange Umprogrammierung erfolgt wie beschrieben (das kann über FACS-Analyse, CFU-Assays und Gen Profilierung überprüft werden). Sicherstellen, dass 2,13-2,19 Ausbeute richtigen Mengen an Virus Schritte für den Erfolg der Rest des Protokolls erforderlich ist. 3,5-3,7 Schritte sind ebenfalls kritisch, da erfolgreiche Transduktion von Zellen ist von entscheidender Bedeutung für dieses Programm hemogenic induzieren. Die entsprechende Menge an DOX pro Vertiefung transduzierten Zellen müssen konsistent und frisch gehalten werden Expression der Transgene zu gewährleisten (es bedarf also die häufigen Medienwechsel). Obwohl es nicht unbedingt notwendig, Zellkultur im Dunkeln, wenn DOX verwendet, kann helfen, Verlust von DOX Funktion verhindern. Nach Transduktion, sollten die Zellen eng mit verschiedenen analytischen Methoden (wie FACS und CFU-Assays) unter dem Mikroskop durch Morphologie und getestet überwacht werden, um sicherzustellen, successful Virusübertragung und Neuprogrammierung. Umprogrammiert Zellen können nicht so viele morphologische Veränderungen annehmen, wie erwartet, erfordern die zuvor erwähnten analytischen Methoden als die besten Indikatoren für die richtige Anpassung zu dienen.

Jüngste Studien haben verschiedene Eigenschaften dieses Umprogrammieren Protokoll wie GATA2 in dem TF - Cocktail oder Fibroblasten als Ausgangszellpopulation 31-33 verwendet. Diese Methoden scheinen auch Entwicklungsprogramme während der Reprogrammierung zu induzieren. Andere Strategien während Neuprogrammierung 9,10,25,26 die Bedeutung der hämatopoetischen Nische gezeigt. Die Identifizierung aller Faktoren , die in Umprogrammierung unterstützen wird entscheidend sein , das Protokoll zu entwickeln , die HSZ bona fide aus leicht erreichbar patientenspezifischen Zellen erzeugt. Zusammenfassend beschreiben wir eine Strategie HSC-ähnliche Zellen aus einer induzierten Entwicklungsprozess zu erzeugen, die in Maus-Fibroblasten über induzierbare GATA2, Gfi1b, cFos undETV6 Überexpression. Diese Technologie wird auf das menschliche System übersetzt werden, wo, in Kombination mit anderen veröffentlichten Studien, die Erzeugung von für eine Vielzahl von klinischen Anwendungen patientenspezifische Blutprodukten geeignet ermöglichen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965-092
0.45 μM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18 G needles BD 305195
20 G needles BD 305175
25 G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65 μM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 mm x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

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References

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