Arbeta med Auditory HEI-OC1 celler
Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
Hus Ear Institute-organ Corti en (HEI-OC1) celler är härledda från hörselorganet av en transgen mus 1,2. Inkubering av varje cell från denna transgena mus vid 33 ° C / 10% CO2 (tillåtliga betingelser) inducerar expression av en immortaliserande gen som utlöser de-differentiering och accelererad proliferation; flytta cellerna till 39 ° C / 5% CO2 (icke-tillåtande betingelser) leda till minskad proliferation, differentiering och, åtminstone i fallet med HEI-OC1, celldöd 2,3.
HEI-OC1 celler klenades och karakteriserades i vårt laboratorium över ett decennium sedan, och initiala studier visade att de uttrycker specifika markörer av cochlea hårceller, såsom Prestin, myosin 7a, Atoh1, BDNF, calbindin och calmodulin, men också markörer för att stödja celler såsom connexin 26 och fibroblasttillväxtfaktorreceptor (FGF-R) 2. Därför föreslogs det att HEI-OC1 kunde representera en common stamfader för sensoriska och stödjande celler i organ Corti 2. Parallella studier visade tydligt att arketypiska ototoxiska läkemedel som cisplatin, gentamicin och streptomycin inducerade kaspas-3-aktivering i dessa celler, medan droger anses icke-ototoxiska, som penicillin, inte 2,3. Därför var denna cellinje föreslås som ett in vitro-system för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i ototoxicitet och för screening av potentiella ototoxicitet eller otoprotective egenskaper hos nya farmakologiska läkemedel. Det uppskattas att HEI-OC1 celler har använts i mer än hundra och femtio studier som publicerats under de senaste tio åren.
Medan du tittar på den potentiella pro-apoptotiska effekten av olika läkemedel var viktigt mål för de flesta studier med denna cellinje har andra viktiga cellprocesser som autophagy och åldrande precis börjat utredas i HEI-OC1 celler 4-7. jagna färsk studie från vårt laboratorium 8 använde vi HEI-OC1 celler att samla en omfattande uppsättning data om celldöd, överlevnad, proliferation, åldrande och autophagy inducerad av olika farmakologiska läkemedel som ofta används vid kliniken. Vi jämförde också några av svaren från HEI-OC1-celler med de från HEK-293 (humana embryonala njurceller) och HeLa (humana epitelceller) som fick identisk behandling. Våra resultat indikerade att HEI-OC1-celler svarar på varje läkemedel på ett karakteristiskt sätt, med en distinkt dos- och tidsberoende känslighet för åtminstone en av de mekanismer som studeras. Vi betonade också i denna studie att en korrekt tolkning av de experimentella resultaten kommer att kräva att utföra parallella studier med mer än en teknik 8.
I en annan studie undersökte vi användning av HEI-OC1-celler för att utvärdera den funktionella responsen hos Prestin, motor proteinet av cochlea yttre hårceller (OHCs) 9 </supp>. Vi rapporterade flödescytometri och konfokal laserscanningsmikroskopi studier på mönstret av Prestin uttryck, liksom icke-linjär kapacitans (NLC) och hela cell patch klämstudier i HEI-OC1 celler odlade vid tillåtande (P-HEI-OC1) och icke- tillåtande (NP-HEI-OC1) förhållanden. Våra resultat indikerade att både total Prestin uttryck och plasmamembranlokalisering ökning av ett tidsberoende sätt i NP-HEI-OC1-celler. Intressant nog fann vi också att ökningen i Prestin lokalisering vid plasmamembranet av NP-HEI-OC1-celler korrelerade med en minskning av Na + K + ATPas, som translokeras från plasmamembranet till cytoplasman utan betydande förändringar i den totala celluttryck. Dessutom visade vi att P-HEI-OC1-celler har en robust NLC associerade till Prestin motorik, som minskade när densiteten hos Prestin molekyler som är närvarande vid plasmamembranet ökas. Sammantaget stöder dessa resultat starkt nyttan av HEI-OC1-celler för att undersöka hörsel proteiner.
I denna video artikeln beskriver vi hur kulturen HEI-OC1 celler, varför det är lämpligt att använda celler växer tillåtande betingelser (P-HEI-OC1) för cytotoxicitet studier, hur man ska värdera mekanismen / s av läkemedelsinducerad cytotoxicitet och hur för att utföra elektrofysiologiska studier (t.ex., patch-clamp, icke-linjär kapacitans (NLC)) för att undersöka funktionella egenskaperna hos Prestin, den molekylära motorn av cochlea OHCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna rapport beskriver vi hur kulturen HEI-OC1 celler och använda dem för att utvärdera mekanismerna för läkemedelsinducerad cytotoxicitet och att undersöka funktionella egenskaper Prestin, molekylär motor cochlea OHCs. De tekniska förfaranden är dock allmänt nog att enkelt anpassas till olika studier.
Alla protokoll som beskrivs här kräver korrekt användning av väletablerade cellodlingsteknik 10. Precis som med alla andra cellinje, som arbetar med HEI-OC1 celler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
- Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
- Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
- Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
- Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
- Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
- Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
- Celis, J. E. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).
- Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
- Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
- Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
- Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
- Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
- Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
- Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin’s Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
- Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).
