Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation

Summary

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Abstract

die frühen heterotypic Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der umgebenden Nicht-Krebs-Stroma zu verstehen ist wichtig, um die Ereignisse zu Aufklären Stromatumoren Aktivierung und Einrichtung des Tumor-Mikroumgebung (TME) führt. Mehrere in vitro- und in vivo – Modellen des TME entwickelt worden; im allgemeinen jedoch erlauben diese Modelle nicht ohne weiteres Isolierung einzelner Zellpopulationen, unter nicht-Stören Bedingungen für eine weitere Studie. Um diese Schwierigkeit zu umgehen, haben wir ein in vitro TME – Modell unter Verwendung eines Zellwachstumssubstrat , bestehend aus einem durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz verwendet , die einfache Erzeugung von hoch angereicherten Zellpopulationen erlaubt innig gezüchtet, jedoch getrennt, auf jeder Seite der Membran des Einsatzes für längere co -Kultur mal. Durch die Verwendung dieses Modells sind wir stark angereicherte Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAF) Populationen von normalen diploiden humanen Fibroblasten erzeugen kann folgendeCo-Kultur (120 h) mit stark metastatischen Zellen menschlichen Brustkarzinom, ohne die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung und / oder Zellsortierung. Zusätzlich wird durch die Porengröße des Einsatzes zu modulieren, können wir für den Modus der interzellulären Kommunikation steuern (zB Gap-Junction – Kommunikation, sezerniert Faktoren) zwischen den beiden heterotypic Zellpopulationen, die Untersuchung der Mechanismen , die die Entwicklung der Genehmigungen zugrunde liegenden TME, einschließlich der Rolle der Gap-Junction-Permeabilität. Dieses Modell dient als wertvolles Werkzeug, um unser Verständnis für die anfänglichen Ereignisse bei der Verbesserung, die zu Krebs-Stroma-Initiation, die frühe Entwicklung des TME und die modulierende Wirkung des Stroma auf den Antworten von Krebszellen zu therapeutischen Mitteln.

Introduction

Der Tumor-Mikroumgebung (TME) ist ein hochkomplexes System von Karzinomzellen umfasst, die neben Wirts Stroma koexistieren und sich entwickeln. Diese stromalen Komponente besteht typischerweise aus Fibroblasten, Myofibroblasten, Endothelzellen, verschiedene Immunkomponenten sowie einer extrazellulären Matrix ^1. Ein wesentlicher Bestandteil, oft die Mehrheit dieses Stroma aktiviert Fibroblasten, häufig als krebsassoziierte Fibroblasten oder Karzinom-assoziierten Fibroblasten (CAF) ^2,3 bezeichnet. Im Gegensatz zu normalen, nicht aktivierten Fibroblasten, beitragen CAFs zu Tumor Initiation, Progression, Angiogenese, Invasion, Metastasierung und Wiederholung ^4-11 in einer Vielzahl von Karzinomen, einschließlich Brust-, Prostata-, Lungen-, Pankreas-, Haut-, Darm-, Speiseröhren-, und Ovar ^5,6,12-17. Doch die genaue Art des Beitrags von CAFs gesamten Krebs Pathogenese bleibt schlecht definiert. Darüber hinaus hat die klinische Evidenz einen prognostischen Wert von CAFs demonstriert, Ihre Anwesenheit zu hochwertigen malignen Erkrankungen, Therapieversagen, und die allgemeine schlechte Prognose ^10,18,19 korreliert.

Offensichtlich unser Verständnis der auslösenden Ereignisse in CAF Entwicklung zu verbessern, sowie die interzelluläre Kommunikation, ihre Rolle innerhalb des TME Vermittlung kann spannende neue therapeutische Ziele und verbesserte Strategien, die Patientenergebnisse verbessern könnte. Zu diesem Ziel sind mehrere in vivo und in vitro – Modelle wurden entwickelt. Während in – vivo – Ansätzen mehr reflektierende der Patienten TME sind, besitzen sie Einschränkungen, einschließlich der immensen Komplexität und Heterogenität sowohl innerhalb als auch zwischen Tumoren. Weiterhin Tumorproben von menschlichen Probanden häufig darstellen TME hoch entwickelt und nicht das Verständnis der TME auslösenden Ereignissen ermöglichen. Tierexperimentelle Studien bieten einige Vorteile, aber Verallgemeinerung von Tierdaten auf den Menschen sollten aufgrund von Unterschieden in physi mit Vorsicht erfolgenLogie zwischen Menschen und Tieren, wie Nagetieren (beispielsweise Thiol – Chemie ^20, die Stoffwechselrate ^{21, 22} Toleranz zu betonen, etc.). Außerdem, im Gegensatz zu der menschlichen Bevölkerung, die in der Natur genetisch heterogen ist, werden Labortiere typischerweise bis zur Homogenität gezüchtet. Auch ist es oft schwierig, transient physiologischen Variationen und Zellphänotyp Veränderungen zu untersuchen, sowie zur Kontrolle für bestimmte experimentelle Parameter Tiere wie Nagetieren verwenden. So wird in vitro 2- und 3-dimensionale (2D und 3D) Gewebekulturmodelle werden häufig das grundlegende Verständnis der TME Entwicklung voran verwendet. Trotz ihres Mangels einer genauen Darstellung der Komplexität der in vivo – Systeme bieten diese Modelle Vorteile, die sich stark mechanistische Untersuchungen zu erleichtern. In vitro – Modelle erlauben eine einfachere, konzentriert und kostengünstige Analyse des TME, wobei statistisch signifikante Daten können in erzeugt werdenZellen frei von systemischen Veränderungen, die bei Tieren entstehen.

Es gibt mehrere Arten von in – vitro – Systemen. Die beiden am häufigsten verwendeten TME in vitro – Modelle bestehen aus gemischten Monoschicht oder Sphäroid Zellkulturen. Beide Kulturverfahren vorteilhaft sind für die grundlegende Studien der interzellulären Wechselwirkungen (zB normale Zellen mit Tumorzellen) und für die Analyse verschiedener TME spezifischen Zellphänotyp Veränderungen (beispielsweise Entstehung von Krebs-assoziierten Fibroblasten von normalen Fibroblasten). Zusätzlich werden die Sphäroide Lage , eine reflektierende gewebeartige Struktur des TME zu schaffen, und kann von Tumor Heterogenität ²³ repräsentativ sein. Jedoch Sphäroiden produzieren oft sehr unterschiedlichen Sauerstoffspannung Gradienten über Schichten, die ²⁴ Versuchs Schlussfolgerungen erschweren. Leider sind beide Modelle extrem in ihrer Fähigkeit beschränkt, für die weitere Charakterisierung und Untersuchung folgende Ko- reinen Zellpopulationen zu isolierenKultur. Um dies zu tun würde mindestens ein Zelltyp erforderlich fluoreszenzmarkierten oder markiert mit einer identifiziere maker zu sein, und dann Unterwerfen des gemischten Kokultur umfangreiche Verarbeitung und Zellsortierung, die Zellpopulationen zu trennen. Während ein Zellsortierer eine ziemlich reine Zellpopulation zu isolieren kann, muss man sich bewusst zellulären Stress und eine mögliche mikrobielle Kontamination sein ²⁵ – Risiken.

Zur Erleichterung haben das Verständnis der interzellulären Kommunikation, große Anstrengungen unternommen worden , an der Entwicklung und in vitro – Systemen zu optimieren , die eng an die in – vivo – Umgebung nachzuahmen, während eine vereinfachte Ansatz erlaubt. Ein solches Instrument ist die durchlässige mikroporöse Einlage, ein Membransubstrat , die zuerst im Jahre 1953 entwickelt wurde , ²⁶ und anschließend angepasst für vielfältige Anwendungen und Studien (zB Zellpolarität ^27, Endozytose ^28, Drogentransport ^29, Modellierung Gewebe ^30, fertlisation ^31, Bystander – Effekt ^32,33, etc.). Dieses System ermöglicht das Wachstum von Zellen , die mit in vivo -ähnlichen anatomischen und funktionellen Differenzierung sowie die Expression von vielen in vivo – Marker ^34,35 , die beobachtet werden , wenn nicht kultiviert auf undurchlässige Kunststoffgeschirr . Weiterhin erlaubt die äußerst dünne poröse Membran (10 & mgr; m dick) , eine schnelle Diffusion von Molekülen und Äquilibrierungszeiten, die die in vivo – Umgebung simuliert , und ermöglicht unabhängige zelluläre Funktion an den beiden apikalen und basolateralen Zelldomänen. Ein zusätzlicher Vorteil der Nützlichkeit des Einsatzes als TME Systems ist die physikalische Trennung von zwei Populationen heterotypic Zelle auf jeder Seite der Membran in den gleichen Umgebungsbedingungen wachsen gelassen, während verschiedene Arten der interzellulären Kommunikation durch die Membranporen gehalten wird. Obwohl physikalisch getrennt sind, werden die beiden Zellpopulationen metabolisch gekoppelt via sekretiertes Elemente und als dehier, auch durch den Spalt-junctional Kanäle beschrieben. Zusätzlich wird durch die Einsätze bei in vivo partielle Sauerstoffspannung (PO ₂₎ beibehalten wird , reduziert das Modell die Komplikationen von Sauerstoff und chemische in anderen Systemen beobachtet Steigungen. Vielmehr erhöht es das Verständnis der natürlichen Mechanismen der TME-Steuerung. Insbesondere können die beiden Zellpopulationen leicht mit hoher Reinheit, ohne Fluoreszenzmarkierung und / oder Zellsortierung nach länger andauernder Kokultur isoliert werden.

Hier beschreiben wir ein in vitro – Protokoll TME bestehend aus menschlichen Brustkarzinomzellen und humanen Fibroblasten gezüchtet, die jeweils auf beiden Seiten einer durchlässigen mikroporösen Membraneinsatzes, aber dennoch im kontinuierlichen bidirektionale Kommunikation durch die Membranporen. Wir zeigen , dass durch Membranen mit unterschiedlichen Porengrößen, der Beitrag einer bestimmten Art von interzellulären Kommunikation (beispielsweise sezernierte Faktoren gegen gap junctions) mit der Entwicklung mitkann der TME untersucht werden.

Protocol

1. Herstellung von Kulturmedien und Zellen Bereiten 500 ml Eagle-Minimalmedium, ergänzt mit 12,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin und 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin pro ml. HINWEIS: Das Wachstumsmedium und Ergänzung (en) kann leicht für die Wachstumsanforderungen von anderen Zellstämmen oder Zelllinien ausgetauscht werden. Vorbereitung 70 & mgr; l Zellkulturmedium für jeden Einsatz (6-well Format insert): essentiel…

Representative Results

Angepasst hier wir einen durchlässigen Einsatz mikroporöse Membran eine in vitro Zell heterotypic Cokultur – System zu entwickeln, das die in vivo Tumor – Mikroumgebung (Abbildung 1) nachahmt. Dieses System ermöglicht es für zwei verschiedene Zellpopulationen, die auf beiden Seiten der porösen Membran für längere Zeiträume des Einsatzes angebaut werden (bis zu 120 Stunden, in unserer Anwendung). Wichtig ist das System in der Lage ist, die Reinhe…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfaches, anpassungsfähig in vitro – Verfahren (Abbildung 1) , die eine durchlässige mikroporöse Membran verwendet Einsatz aus einer Co-Kultur von Zellen heterotypic hoch angereicherten einzelnen Zellpopulationen zu erzeugen. Bezeichnenderweise ist das Modell für verschiedene Arten der interzellulären Kommunikation zu untersuchen. Die kritischen Schritte umfassen die geeignete Porengröße Einsatz für spezielle experimentelle Interesse (e) Auswahl …

Materials

For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line	PerkinElmer	119261	Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore)	Costar	3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore)	Costar	3452
6-well Culture Plate	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 cell culture flask	CellStar	658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X	Corning Cellgro	21-040-CV	without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 mL Centrifuge Tube	CellTreat	229411
35 x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence – 1:5000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence – 1:2000
Bovine Serum Albumin – Fraction V	Rockland	BSA-50	Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution	ThermoFisher Scientific	28908	Dilute to 4% with 1X PBS
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot – 1:10000
Tween-20	BioRad	170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioRad	161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	161-0158