ट्यूमर microenvironment की नकल: समृद्ध सेल आबादी सृजन और जांच कहनेवाला संचार के लिए एक सरल विधि
Summary
We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.
Abstract
कैंसर की कोशिकाओं और आसपास के गैर कैंसर स्ट्रोमा के बीच जल्दी heterotypic बातचीत को समझने की घटनाओं stromal सक्रियण और ट्यूमर microenvironment (TME) की स्थापना के लिए अग्रणी elucidating में महत्वपूर्ण है। इन विट्रो में और TME के vivo मॉडल में कई विकसित किया गया है; हालांकि, सामान्य रूप में इन मॉडलों को आसानी से अलग-अलग सेल आबादी के अलगाव की अनुमति नहीं है, गैर-perturbing परिस्थितियों में, आगे के अध्ययन के लिए। इस कठिनाई को नाकाम करने के लिए, हम एक पारगम्य microporous झिल्ली डालें कि अच्छी तरह से वृद्धि हुई अत्यधिक समृद्ध सेल आबादी के सरल पीढ़ी, अभी तक अलग से परमिट से मिलकर एक सेल के विकास सब्सट्रेट का उपयोग इन विट्रो TME मॉडल कार्यरत है विस्तारित सह के लिए डालने की झिल्ली के दोनों तरफ, -culture बार। इस मॉडल के उपयोग के माध्यम से, हम (सीएएफ) सामान्य द्विगुणित मानव fibroblasts से आबादी निम्न बहुत समृद्ध कैंसर से जुड़े fibroblast पैदा करने में सक्षम हैंसह संस्कृति (120 एचआर) अत्यधिक मेटास्टेटिक मानव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ, फ्लोरोसेंट टैगिंग और / या सेल छँटाई के उपयोग के बिना। इसके अतिरिक्त, डालने के ध्यान में लीन होना आकार के नियमन से, हम दो heterotypic सेल आबादी के बीच कहनेवाला संचार (जैसे, अंतर-जंक्शन संचार, स्रावित कारकों) की विधा है, जो तंत्र के विकास अंतर्निहित की जांच के परमिट के लिए नियंत्रित कर सकते हैं TME, अंतर-जंक्शन पारगम्यता की भूमिका भी शामिल है। यह मॉडल प्रारंभिक कैंसर स्ट्रोमा दीक्षा, TME के प्रारंभिक विकास, और चिकित्सीय एजेंट को कैंसर की कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं पर स्ट्रोमा के नियमन प्रभाव के लिए प्रमुख घटनाओं के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में कार्य करता है।
Introduction
ट्यूमर microenvironment (TME) एक अत्यधिक जटिल कार्सिनोमा कोशिकाओं है कि सह अस्तित्व और मेजबान स्ट्रोमा के साथ विकसित के शामिल प्रणाली है। यह stromal घटक आम तौर पर fibroblasts, myofibroblasts, endothelial कोशिकाओं, विभिन्न प्रतिरक्षा घटकों, साथ ही एक बाह्य मैट्रिक्स 1 के होते हैं। एक महत्वपूर्ण घटक है, अक्सर इस स्ट्रोमा का बहुमत है, सक्रिय fibroblasts, अक्सर कैंसर से जुड़े fibroblasts या कार्सिनोमा जुड़े fibroblasts (सीएएफ) 2,3 के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। सामान्य, गैर सक्रिय fibroblasts के विपरीत, cafs ट्यूमर दीक्षा, प्रगति, angiogenesis, आक्रमण, मेटास्टेसिस, और पुनरावृत्ति 4-11 कार्सिनोमा की एक विस्तृत विविधता, स्तन, प्रोस्टेट, फेफड़े, अग्न्याशय, त्वचा, पेट, घेघा सहित करने के लिए योगदान है, और अंडाशय 5,6,12-17। फिर भी, कैंसर रोगजनन भर cafs के योगदान का सही स्वरूप खराब परिभाषित रहता है। इसके अलावा, नैदानिक सबूत cafs की एक शकुन मूल्य का प्रदर्शन किया है, उच्च ग्रेड कैंसर, चिकित्सा विफलता है, और समग्र गरीब रोग का निदान करने के लिए 10,18,19 उनकी उपस्थिति correlating।
जाहिर है, सीएएफ विकास में की शुरुआत की घटनाओं, साथ ही कहनेवाला संचार TME के भीतर अपनी भूमिका में मध्यस्थता के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने, रोमांचक नई चिकित्सकीय लक्ष्यों को और बढ़ाया रणनीति है कि रोगी परिणामों में सुधार कर सकते हैं प्रदान कर सकता है। इस लक्ष्य की ओर, vivo में इन विट्रो मॉडल में कई विकसित किया गया है। जबकि इन विवो दृष्टिकोण मरीजों के TME के और अधिक चिंतनशील रहे हैं, वे बहुत जटिलता और विविधता दोनों के भीतर और ट्यूमर के बीच सहित सीमाओं, अधिकारी। इसके अलावा, मानव विषयों से ट्यूमर के नमूनों अक्सर अत्यधिक TME विकसित प्रतिनिधित्व करते हैं और TME की शुरुआत की घटनाओं में से एक समझ की अनुमति नहीं देते। प्रायोगिक जानवरों के अध्ययन श्री बुश में मतभेद के कारण कुछ फायदे हैं, तथापि मनुष्य के लिए पशु डेटा का सामान्यीकरण सावधानी से किया जाना चाहिए प्रदान करते हैंमनुष्यों और पशुओं के ऐसे मूषक (जैसे, thiol रसायन विज्ञान 20, चयापचय दर 21, सहिष्णुता 22 पर जोर देना, आदि) के रूप में के बीच ology। इसके अलावा, मानव आबादी है, जो प्रकृति में आनुवंशिक रूप से विषम है के विपरीत, प्रयोगशाला पशुओं आम तौर पर एकरूपता के लिए पैदा कर रहे हैं। इसके अलावा, यह अक्सर क्षणिक शारीरिक बदलाव और सेल phenotype परिवर्तन की जांच करने के लिए, साथ ही विशिष्ट प्रयोगात्मक ऐसे मूषक के रूप में पशुओं का उपयोग कर मापदंडों के लिए नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है। इस प्रकार, इन विट्रो 2 और 3-आयामी (2 डी और 3 डी) टिशू कल्चर मॉडल में अक्सर TME विकास की बुनियादी समझ अग्रिम करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन विवो प्रणालियों की जटिलता का एक सटीक चित्रण की कमी के बावजूद, इन मॉडलों लाभ है कि बहुत यंत्रवत जांच की सुविधा प्रदान करते हैं। इन विट्रो मॉडल TME के एक अधिक सरल केंद्रित है, और लागत प्रभावी विश्लेषण के लिए, जिससे सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अनुमति देते हैं डेटा में उत्पन्न किया जा सकताप्रणालीगत बदलाव है कि जानवरों में पैदा की स्वतंत्र कोशिकाओं।
वहाँ इन विट्रो प्रणालियों के कई किस्में हैं। दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया TME इन विट्रो मॉडल मिश्रित monolayer या अंडाकार आकृति सेल संस्कृतियों से मिलकर बनता है। दोनों संस्कृति तरीकों कहनेवाला बातचीत और विभिन्न TME विशेष सेल phenotype परिवर्तन के विश्लेषण के लिए (जैसे, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सामान्य कोशिकाओं) की बुनियादी पढ़ाई के लिए फायदेमंद हैं (जैसे, सामान्य fibroblasts से कैंसर से जुड़े fibroblasts के उद्भव)। इसके अतिरिक्त, spheroids TME का एक और अधिक चिंतनशील ऊतक की तरह संरचना बनाने में सक्षम हैं, और ट्यूमर विविधता 23 का प्रतिनिधि हो सकता है। हालांकि spheroids अक्सर परतों में व्यापक रूप से अलग ऑक्सीजन तनाव ढ़ाल, जो प्रयोगात्मक निष्कर्ष 24 को मुश्किल हो सकती उत्पादन। दुर्भाग्य से, दोनों मॉडलों अत्यंत आगे लक्षण वर्णन और अध्ययन के सह निम्नलिखित के लिए शुद्ध सेल आबादी को अलग-थलग करने की क्षमता में सीमित कर रहे हैंसंस्कृति। ऐसा करने के लिए fluorescently टैग या एक की पहचान निर्माता के साथ लेबल है, और फिर व्यापक संसाधन और सेल के लिए मिश्रित सह संस्कृति को subjecting सेल आबादी को अलग करने की छँटाई होना करने के लिए कम से कम एक सेल प्रकार की आवश्यकता होगी। जबकि एक सेल सॉर्टर एक नहीं बल्कि शुद्ध सेल की आबादी को अलग-थलग करने में सक्षम है, एक सेलुलर तनाव और संभावित माइक्रोबियल संदूषण के जानकार जोखिम 25 होना चाहिए।
कहनेवाला संचार की समझ की सुविधा के लिए, महान प्रयासों के विकास और इन विट्रो प्रणालियों है कि निकट vivo वातावरण की नकल है, जबकि एक सरलीकृत दृष्टिकोण की अनुमति देने में अनुकूलन के प्रति समर्पित किया गया है। ऐसा ही एक उपकरण पारगम्य microporous डालने, एक झिल्ली सब्सट्रेट है कि पहली बार 1953 26 में विकसित किया गया था और बाद में विभिन्न अनुप्रयोगों और अध्ययन (जैसे, सेल polarity 27, endocytosis 28, दवा परिवहन 29, ऊतक मॉडलिंग 30, फर्टिलाइजर्स के लिए अनुकूलित हैilization 31, दर्शक प्रभाव 32,33, आदि)। इस प्रणाली मार्करों 34,35 कि जब अभेद्य plasticware पर सुसंस्कृत नहीं मनाया जाता है vivo में इन विवो तरह संरचनात्मक और कार्यात्मक भेदभाव के साथ कोशिकाओं के विकास के साथ-साथ कई की अभिव्यक्ति के लिए परमिट। इसके अलावा, अत्यंत पतली झिल्ली झरझरा (10 माइक्रोन मोटी) अणुओं और संतुलन बार का तेजी से प्रसार, जो इन विवो पर्यावरण simulates और दोनों शिखर और basolateral सेल डोमेन पर स्वतंत्र सेलुलर कामकाज परमिट परमिट। जबकि झिल्ली छिद्रों के माध्यम से कहनेवाला संचार के विभिन्न साधनों को बनाए रखने के लिए एक प्रणाली के रूप में TME डालने की उपयोगिता का एक अतिरिक्त लाभ, एक ही पर्यावरण की स्थिति में झिल्ली के दोनों तरफ बड़े हो गए दो heterotypic सेल आबादी की अपनी शारीरिक जुदाई है। हालांकि शारीरिक रूप से अलग दो सेल आबादी पाचन secreted तत्वों के माध्यम से मिलकर कर रहे हैं और डी के रूप में,यहाँ मानते भी खाई-जंक्शनल चैनलों के माध्यम से। इसके अतिरिक्त, इन विवो आंशिक ऑक्सीजन तनाव में सम्मिलित करता है (पीओ 2) बनाए रखने के द्वारा, मॉडल अन्य प्रणालियों में मनाया ऑक्सीजन और रासायनिक ढ़ाल की जटिलताओं को कम कर देता। दरअसल, यह प्राकृतिक TME नियंत्रित तंत्र की समझ बढ़ जाती है। विशेष रूप से, दो सेल आबादी आसानी से, उच्च शुद्धता के साथ अलग किया जा सकता फ्लोरोसेंट टैगिंग और / या सेल छँटाई सह संस्कृति की विस्तारित अवधि के बाद बिना।
यहाँ हम झिल्ली छिद्रों के माध्यम से निरंतर द्वि-दिशात्मक संचार में इन विट्रो TME मानव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और मानव fibroblasts, उगाया क्रमश: एक पारगम्य microporous झिल्ली डालने के दोनों तरफ से मिलकर प्रोटोकॉल का वर्णन है, लेकिन अभी तक। हम बताते हैं कि विकास के लिए, कहनेवाला संचार का एक विशिष्ट प्रकार का योगदान (जैसे, स्रावित अंतराल जंक्शनों बनाम कारकों) अलग ताकना आकार के साथ झिल्ली का उपयोग करकेTME की जांच की जा सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक सरल, इन विट्रो प्रक्रिया में अनुकूलनीय (चित्रा 1) एक पारगम्य microporous झिल्ली डालने heterotypic कोशिकाओं के एक सह-संस्कृति से अलग-अलग सेल आबादी अत्यधिक समृद्ध उत्पन्न करने के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).
Materials
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 mL Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence – 1:5000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence – 1:2000 |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1X PBS |
| Premium Cover Glass (22×22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot – 1:10000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
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