Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando

Summary

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Abstract

La comprensión de las interacciones tempranas heterotípicos entre las células cancerosas y el estroma no canceroso que rodea es importante en el esclarecimiento de los acontecimientos que conducen a la activación del estroma y el establecimiento del microambiente tumoral (TME). Varios in vitro y en modelos in vivo de la TME se han desarrollado; Sin embargo, en general, estos modelos no permiten fácilmente el aislamiento de poblaciones de células individuales, en condiciones no perturbar, para su posterior estudio. Para evitar esta dificultad, se ha empleado un modelo TME in vitro usando un sustrato de crecimiento de las células que consta de un inserto de membrana microporosa permeable que permite la generación sencilla de poblaciones de células altamente enriquecido crecido íntimamente, sin embargo, por separado, a cada lado de la membrana de la pieza de inserción para co extendida -Cultura veces. Mediante el uso de este modelo, que somos capaces de generar fibroblastos enormemente enriquecido asociada al cáncer (CAF) las poblaciones de fibroblastos humanos diploides normales siguienteco-cultivo (120 horas) con células de carcinoma de mama humano altamente metastásicas, sin el uso de marcado fluorescente y / o la clasificación de células. Además, mediante la modulación del tamaño de poro de la inserción, se puede controlar para el modo de comunicación intercelular (por ejemplo, comunicación brecha cruce, factores secretados) entre las dos poblaciones de células heterotípicos, que permite la investigación de los mecanismos subyacentes al desarrollo de la TME, incluyendo el papel de la permeabilidad brecha de la salida. Este modelo sirve como una herramienta valiosa en la mejora de la comprensión de los eventos iniciales que conducen a la iniciación del cáncer de estroma, la evolución temprana de la TME, y el efecto de modulación del estroma en las respuestas de las células cancerosas a los agentes terapéuticos.

Introduction

El microambiente tumoral (TME) es un sistema altamente complejo compuesto de células de carcinoma que coexisten y evolucionar junto estroma huésped. Este componente estromal típicamente consiste en fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, varios componentes inmunológicos, así como una matriz extracelular ^1. Un constituyente importante, a menudo la mayoría de este estroma, son fibroblastos activados, refiere con frecuencia como fibroblastos asociados al cáncer o fibroblastos de carcinoma asociada (CAF) ^2,3. A diferencia de los fibroblastos normales, no activado, CAF contribuyen a la iniciación del tumor, la progresión, la angiogénesis, invasión, metástasis y la recurrencia ^4-11 en una amplia variedad de carcinomas, incluyendo cáncer de mama, próstata, pulmón, páncreas, piel, colon, esófago, y ovario ^5,6,12-17. Sin embargo, la naturaleza exacta de la contribución de CAF en toda la patogénesis del cáncer sigue siendo mal definidos. Por otra parte, la evidencia clínica ha demostrado un valor pronóstico de la CAF, Correlacionando su presencia a los tumores malignos de alto grado, los fracasos terapéuticos, y pobres en general ^10,18,19 pronóstico.

Claramente, la mejora de nuestra comprensión de los sucesos iniciadores en el desarrollo de la CAF, así como las comunicaciones intercelulares que median su papel dentro de la TME, puede proporcionar emocionantes nuevas dianas terapéuticas y estrategias mejoradas que podrían mejorar los resultados del paciente. Hacia este objetivo, varios en vivo y en modelos in vitro han sido desarrollados. Si bien los métodos in vivo son más un reflejo de TME de los pacientes, poseen limitaciones, incluyendo la inmensa complejidad y heterogeneidad tanto dentro como entre los tumores. Por otra parte, las muestras tumorales procedentes de sujetos humanos a menudo representan muy desarrollados TME y no permiten una comprensión de los sucesos iniciadores TME. los estudios en animales experimentales ofrecen algunas ventajas, sin embargo, la generalización de los datos en animales a los seres humanos debe hacerse con precaución debido a las diferencias en physiology entre humanos y animales tales como roedores (por ejemplo, la química de tiol ^20, la tasa metabólica ^21, tolerancia al estrés ^22, etc.). Además, a diferencia de la población humana, que es genéticamente heterogénea en la naturaleza, los animales de laboratorio son típicamente criados para la homogeneidad. Además, a menudo es difícil de examinar variaciones fisiológicas transitorios y los cambios del fenotipo de células, así como para el control de los parámetros experimentales específicos utilizando animales tales como roedores. Por lo tanto, 2- in vitro y modelos de cultivo de tejidos de 3 dimensiones (2D y 3D) son frecuentemente utilizados para avanzar en el conocimiento básico del desarrollo de TME. A pesar de su falta de una representación exacta de la complejidad de los sistemas in vivo, estos modelos ofrecen ventajas que facilitan en gran medida las investigaciones mecanicistas. Modelos in vitro permiten un análisis más simplificado, enfocado, y rentable de la TME, por lo que estadísticamente significativa los datos pueden ser generados encélulas libres de variaciones sistémicas que surgen en los animales.

Hay varias variedades de sistemas in vitro. Los dos modelos TME in vitro utilizados más comúnmente consisten en monocapa mixta o cultivos celulares esferoides. Ambos métodos de cultivo son ventajosas para estudios básicos de interacciones intercelulares (por ejemplo, células normales con células tumorales) y para el análisis de varios cambios de fenotipo celular específicos TME (por ejemplo, la aparición de los fibroblastos asociados con el cáncer de fibroblastos normales). Además, los esferoides son capaces de crear una estructura similar a un tejido más reflexiva del TME, y pueden ser representativos de la heterogeneidad del tumor ^23. Sin embargo esferoides menudo producen muy diversos gradientes de tensión de oxígeno a través de capas, que pueden complicar conclusiones experimentales ^24. Desafortunadamente, ambos modelos son extremadamente limitados en su capacidad para aislar poblaciones de células puras para su posterior caracterización y estudio siguiente co-cultura. Para ello, sería necesario al menos un tipo de célula que ser marcado con fluorescencia-o etiquetados con un fabricante de identificación, y luego someter el co-cultivo mixto a la extensa procesamiento y clasificación de células para separar las poblaciones de células. Mientras que un clasificador de células es capaz de aislar una población de células en lugar puro, uno debe ser consciente de estrés celular y la contaminación microbiana riesgos potenciales ^25.

Para facilitar la comprensión de la comunicación intercelular, grandes esfuerzos se han dedicado a desarrollar y optimizar en sistemas in vitro que imitan estrechamente el entorno in vivo, al tiempo que permite un enfoque simplificado. Una de estas herramientas es la inserción microporosa permeable, un sustrato de membrana que fue desarrollado por primera vez en 1953 ²⁶ y posteriormente adaptado para diversas aplicaciones y estudios (por ejemplo, la polaridad celular ^{27, 28} endocitosis, transporte de drogas ^29, el modelado de tejido ^30, FERTilization ^31, efecto espectador ^32,33, etc.). Este sistema permite el crecimiento de las células con anatómica in vivo -como y la diferenciación funcional, así como la expresión de muchos en vivo marcadores ^34,35 que no se observó cuando se cultivan en recipientes de plástico impermeable. Además, la membrana porosa extremadamente delgada (10 micras de espesor) permite la rápida difusión de las moléculas y los tiempos de equilibrio, que simula el entorno in vivo y permite el funcionamiento celular independiente en los dominios de células apical y basolateral. Una ventaja adicional de la utilidad de la inserción como un sistema de TME es su separación física de dos poblaciones de células cultivadas heterotípicos a cada lado de la membrana en las mismas condiciones ambientales, mientras que el mantenimiento de los diversos modos de comunicación intercelular a través de los poros de la membrana. Aunque físicamente separados, las dos poblaciones de células se acoplan metabólicamente a través de elementos secretadas y, como dedescribe aquí, también a través de los canales de gap-unión. Además, mediante el mantenimiento de las piezas de inserción en la tensión de oxígeno in vivo parcial (PO _2), el modelo reduce las complicaciones de oxígeno y químicas gradientes observados en otros sistemas. Más bien, se aumenta la comprensión de los mecanismos naturales que controlan el TME. En particular, las dos poblaciones de células pueden ser fácilmente aislados con alta pureza, sin el etiquetado fluorescente y / o la clasificación de células después de períodos prolongados de co-cultivo.

Aquí se describe un protocolo TME in vitro que consiste en células de carcinoma de mama humano y fibroblastos humanos cultivados, respectivamente, a ambos lados de un inserto de membrana microporosa permeable, pero todavía en continua comunicación bidireccional a través de los poros de la membrana. Se demuestra que mediante el uso de membranas con diferentes tamaños de poro, la contribución de un tipo específico de la comunicación intercelular (por ejemplo, factores secretados frente a uniones gap) para el desarrollode la TME pueden ser investigados.

Protocol

1. Preparación de medios de cultivo y las células Preparar 500 ml de medio de Eagle esencial mínimo suplementado con 12,5% (vol / vol) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamina, y 100 unidades de penicilina y 100 mg de estreptomicina por ml. NOTA: El medio de crecimiento y suplemento (s) se puede cambiar fácilmente para los requisitos de crecimiento de otras cepas de células o líneas celulares. Preparar 70 l de medio de cultivo celular para cada pieza d…

Representative Results

Aquí hemos adaptado un inserto de membrana microporosa permeable para desarrollar un sistema de células de co-cultivo heterotípicos in vitro que imita el microambiente tumoral in vivo (Figura 1). Este sistema permite que dos poblaciones diferentes de células que se cultivan en cada lado de la membrana porosa de la pieza de inserción para largos períodos de tiempo (hasta 120 horas, en el uso). Es importante destacar que el sistema es capaz de mante…

Discussion

El protocolo descrito aquí es un simple, adaptable en procedimiento in vitro (Figura 1) que utiliza un inserto de membrana microporosa permeable para generar poblaciones de células individuales altamente enriquecido de un co-cultivo de células heterotípicos. De manera significativa, el modelo es adecuado para la investigación de diversos medios de comunicación intercelular. Los pasos críticos incluyen la selección de la pieza de inserción de tamaño de poro apropiado para el i…

Materials

For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line	PerkinElmer	119261	Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore)	Costar	3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore)	Costar	3452
6-well Culture Plate	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 cell culture flask	CellStar	658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X	Corning Cellgro	21-040-CV	without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 mL Centrifuge Tube	CellTreat	229411
35 x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence – 1:5000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence – 1:2000
Bovine Serum Albumin – Fraction V	Rockland	BSA-50	Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution	ThermoFisher Scientific	28908	Dilute to 4% with 1X PBS
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot – 1:10000
Tween-20	BioRad	170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioRad	161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	161-0158