Néonatale cardiaque Echafaudages: Matrices nouveaux pour Études régénératives

Summary

Dans ces études, nous fournissons une méthodologie pour de nouvelles, échafauds cardiaques néonatales, murins pour une utilisation dans les études de régénération.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

L'insuffisance cardiaque est fréquente et mortelle. Il est une maladie progressive qui se traduit par une diminution de la contractilité du coeur, ce qui altère le flux sanguin vers les organes et laisse les besoins métaboliques de la non satisfaite du corps. On estime que 5,7 millions d' Américains ont une insuffisance cardiaque et il est la principale cause d'hospitalisation aux États-Unis ^9. Le coût collectif de traitement des patients en insuffisance cardiaque aux États-Unis dépasse les 300 milliards de dollars par an ^9-10. Le seul traitement définitif de l'insuffisance cardiaque au stade terminal est une greffe cardiaque orthotopique. Chaque année, on estime que plus de 100.000 coeurs donateurs sont nécessaires pour les procédures de transplantation cardiaque aux États-Unis ^1-2. En raison du nombre limité de donateurs, seuls environ 2.400 transplantations sont réalisées chaque année aux États – Unis ^2. De toute évidence, cette pénurie d'organes doit être abordée que d'autres stratégies sont nécessaires pour produire des organes supplémentaires pour transplantationtion et, idéalement, ces organes seraient autologue de manière à éviter les complications associées au rejet et de la durée de vie immunosuppression.

Cardiomyocytes adultes Mammifères démontrent une capacité de régénération limitée sur blessure , mais des données récentes suggèrent que les cœurs néonatals mammifères maintiennent une capacité de régénération remarquable suite à une lésion ^5-8. Plus précisément, après une résection chirurgicale partielle, une fenêtre de régénération a été découverte entre la naissance et le jour post – natal 7. Cette période de régénération se caractérise par une absence de cicatrice fibrotique, la formation de la néovascularisation, la libération de facteurs angiogéniques , de l'épicarde, et la prolifération des cardiomyocytes ^{8/5 , 11.} Cette fenêtre de régénération du temps fournit la possibilité d'utiliser le cœur du nouveau-né comme une nouvelle source de matériel pour le développement d'un cœur bioartificiel.

La matrice extracellulaire est connu pour fournir des indices importants pour promouvoir cardiomyocyte prolifération et la croissance. Différences distinctes dans la disponibilité des molécules dans les matrices néonatales et adultes ¹² et leur capacité à promouvoir la régénération ont été explorées ^13. les matrices adultes décellularisés ont été utilisées dans plusieurs études pour fournir un échafaudage de l'ECM pour la repopulation cellulaire et la génération d'un coeur bioartificiel. Bien que ces études, et de nouvelles découvertes dans les technologies de cellules souches, progressent rapidement, plusieurs obstacles doivent encore être remplies. Par exemple, les limitations dans la préservation de la structure native de la matrice, l'intégration cellulaire dans la paroi de la matrice, et la capacité de soutenir la prolifération et à la croissance de toute limite le succès de cette approche. Alors que les attributs de régénération supérieures ont été attribuées au cœur du nouveau-né, les aspects pratiques de l'utilisation d'un tel tissu ont limité son exploration.

Sur la base de la capacité de régénération démontré du cœur néonatale, nous avons développé de nouvelles matrices en développant unetechnique de décellularisation pour le coeur P3 de la souris. Le cœur P3 a été choisi pour ces études car il est dans la fenêtre de régénération cardiaque comme précédemment déterminé ⁶ mais le cœur est assez grand pour la récolte, decellularize et recellularize. Le but de cette étude est de démontrer la faisabilité de la création d'une matrice à partir d'un cœur de souris néonatale. Nos études fournissent des preuves de la faisabilité de décellularisation d'une minute, le cœur du nouveau-né, tout en maintenant l'intégrité structurelle et protéinique de l'ECM. Nous démontrons également la capacité de recellularize cette ECM cardiaque avec mCherry cardiomyocytes exprimant et nous avons examiné ces cardiomyocytes pour l'expression de différents marqueurs cardiaques suivants recellularization. Cette technologie permet à l'essai de la supériorité d'une matrice du nouveau-né à l'élaboration d'un coeur bioartificiel.

Protocol

Toutes les expériences de souris ont été effectuées en conformité avec loi sur la protection des animaux et des États-Unis ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université du Minnesota. 1. Méthode de coeur Souris Isolation Euthanasier une souris néonatale par décapitation avec une lame à usage unique. Badigeonner le thorax avec 70% d'éthanol. Disséquer la peau de la poitrine en réduisant l'écart de…

Representative Results

décellularisation En moyenne, le temps de décellularisation d'un cœur de P3 en utilisant ce protocole est d'environ 14 heures. étant donné un poids cardiaque moyenne de 23 mg pour le nouveau-né de P3. Acellularity Figure 3a montre un coeur néonatal P3 intact (toute la montagne). Figure 3b montre le même cœur suivant décellularisation. Les <stron…

Discussion

La dépendance de cette technique sur des perfusions répétées du cœur fait éviter d'une embolie, une composante essentielle d'un résultat positif. À partir de la première cathétérisation du cœur dans les étapes 2,2-2,6, aux changements de solution entre les étapes 2.8-2.14, il y a des manipulations qui peuvent permettre l'introduction de bulles d'air qui compromettent l'écoulement du liquide de perfusion dans le myocarde. En raison de la petite taille du cœur du nouveau-né, même de m…

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.