Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies

Summary

In diesen Studien bieten wir Methodik für Roman, Neugeborenen, murine Herzgerüste für den Einsatz in der regenerativen Studien.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

Herzinsuffizienz ist häufig und tödlich. Es ist eine progressive Erkrankung, die zu einer verminderten Kontraktilität des Herzens führt, die Durchblutung von Organen und lässt die metabolischen Anforderungen des Körpers unerfüllten beeinträchtigt. Es wird geschätzt , dass 5,7 Millionen Amerikaner an Herzinsuffizienz leiden , und es ist die Hauptursache für Hospitalisierung in den Vereinigten Staaten ^9. Die kollektive Kosten der Patienten bei Herzinsuffizienz in den Vereinigten Staaten die Behandlung von mehr als 300.000.000.000 $ Dollar pro Jahr ^9-10. Die einzige definitive Therapie für Endstadium Herzinsuffizienz ist orthotope Herztransplantation. Jedes Jahr wird geschätzt , dass mehr als 100.000 Spenderherzen für Herztransplantationsverfahren in den Vereinigten Staaten ^1-2 benötigt werden. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Spendern werden nur rund 2.400 Transplantationen pro Jahr in den USA ² durchgeführt. Offensichtlich muss diese Organmangel behandelt werden als andere Strategien erforderlich sind, für transplanta zusätzliche Organe zu produzierention und im Idealfall würden diese Organe autologe, um die Komplikationen, die mit Ablehnung und Lebensdauer Immunsuppression verbunden zu vermeiden.

Mammalian adulten Kardiomyozyten zeigen eine begrenzte Regenerationsfähigkeit auf Verletzung aber die jüngsten Hinweise darauf , dass Säugetier-neonatalen Herzen eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen ^5-8 halten. Insbesondere folgende Teil chirurgische Resektion, ein regeneratives Fenster wurde zwischen der Geburt und der postnatalen Tag entdeckt 7. Diese regenerative Periode wird durch einen Mangel an fibrotische Narbe, die Bildung von Neovaskularisation, die Freisetzung von angiogenen Faktoren aus dem Epikard und Kardiomyozyten Proliferation ^{5-8 , 11.} Diese regenerative Zeitfenster bietet das Potenzial für die Neugeborenen-Herz als neuartige Materialquelle für die Entwicklung eines bioartifiziellen Herz verwenden.

Die extrazelluläre Matrix ist bekannt, wichtige Hinweise zur Verfügung zu stellen cardiomyocyt zu förderne Proliferation und Wachstum. Deutliche Unterschiede in der Verfügbarkeit von Molekülen in der neonatalen und adulten Matrizen ¹² und ihre Fähigkeit , die Regeneration zu fördern , wurden ¹³ untersucht. ein ECM-Gerüsts für zellulare Repopulation zu bieten und die Erzeugung eines bioartifizielle Herz dezellularisierte erwachsenen Matrices wurden in mehreren Studien verwendet. Während diese Studien und neue Entdeckungen in der Stammzellentechnologien werden schnell voran, haben mehrere Hürden noch erfüllt werden. Zum Beispiel, Einschränkungen bei der Erhaltung native Struktur der Matrix, zellulären Integration in die Matrix Wand, und die Fähigkeit, die Proliferation und das Wachstum aller begrenzen den Erfolg dieses Ansatzes zu unterstützen. Während überlegen haben regenerative Attribute der Neugeborenen-Herz zugeschrieben worden ist, haben sich die praktischen Aspekte der Verwendung eines solchen Gewebes seine Explorations begrenzt.

Basierend auf der nachgewiesenen Regenerationsfähigkeit des Neugeborenen-Herz haben wir durch die Entwicklung eines neuartigen Matrizen entwickeltTechnik der Dezellularisierung für die P3 Maus Herz. Der P3 Herz wurde für diese Studien ausgewählt , da es innerhalb des Fensters von Herzregeneration wie zuvor ⁶ bestimmt aber das Herz ist groß genug , um zu ernten, und Dezellularisieren recellularize. Das Ziel dieser Studie ist es, die Durchführbarkeit der Schaffung einer Matrix aus einer neonatalen Mäuseherz zu demonstrieren. Unsere Studien belegen für die Machbarkeit von Dezellularisieren einer Minute, Neugeborenen-Herz, während die strukturelle und proteinöse Integrität des ECM beibehalten wird. Wir zeigen auch die Fähigkeit, dieses Herz-ECM mit mCherry exprimierenden Kardiomyozyten recellularize und wir haben diese Kardiomyozyten für die Expression von verschiedenen kardialen Marker folgende Rezellularisierung sucht. Diese Technologie wird für die Prüfung der Überlegenheit einer neonatalen Matrix für die Entwicklung eines bioartifiziellen Herzens ermöglichen.

Protocol

Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den US-Tierschutzgesetz durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Minnesota genehmigt. 1. Verfahren zur Maus Herz Isolation Euthanize eine Neugeborenen-Maus durch Enthauptung mit einem einzigen Einsatz Klinge. Tupfer, um den Brustkorb mit 70% Ethanol. Präparieren Sie die Haut von der Brust, indem sie es weg von der Brustwand mit Standard-Schere schneiden, während die Haut …

Representative Results

Dezellularisierung Im Durchschnitt ist die Zeit, um Dezellularisierung eines P3 Herz dieses Protokoll verwenden etwa 14 Stunden. eine durchschnittliche Herzgewicht von 23 mg für den P3 Neugeborener gegeben. Acellularity 3a zeigt eine völlig intakte P3 neonatale Herz (whole mount). 3b zeigt das gleiche Herz folgende Dezellularisierung. 4a und di…

Discussion

Die Abhängigkeit dieser Technik auf wiederholte Perfusionen des Herzens ist die Vermeidung einer Embolie eine wichtige Komponente für ein erfolgreiches Ergebnis. Von der anfänglichen Katheterisierung des Herzens in den Schritten 2,2-2,6, zu den Veränderungen der Lösung zwischen den Schritten von 2,8 bis 2,14, sind Manipulationen, die Einführung von Luftblasen, die Kompromiss den Fluss des Perfusats in das Myokard zulassen. Aufgrund der geringen Größe des neonatale Herz, auch in das Gefßsystem winzige Blasen kan…

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.