Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도
Summary
This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.
Abstract
골격 근육 재생이 부상 또는 질병에 대한 응답으로 성인 골격 근육에서 발생하는 생리적 과정이다. 급성 손상 – 유도 골격근 재생 근육 재생뿐만 아니라 메커니즘과 다른 플레이어와 관련된 사건을 연구하기 위해 널리 사용되는 강력한 모델 시스템이다. 사실상,이 프로세스의 상세한 기술은 골격근 변성을 초래할 병적 조건의 이해에 필수적이며, 새로운 표적 치료 전략을 식별 돕는다. 본 연구는 cardiotoxin의 단일 근육 내 주사 (CTX)를 통해 마우스의 급성 골격 근육의 재생을 유도하는 상세하고 재생 가능한 프로토콜을 설명합니다. CTX는 뱀 독 독소의 가족에 속하고 결국 재생 이벤트를 트리거 근섬유의 근종 용해술을 발생합니다. 골격 근육 재생의 역학은 근육 부분의 조직 학적 분석에 의해 평가된다. 또한 프로토콜해부 동결 및 경골근 근육뿐만 아니라 널리 후속 학적 및 형태 계측 학적 분석에 사용되는 루틴을 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 절단 실험 절차를 도시한다.
Introduction
포유류 성인 골격 근육 수축 전문화 다핵 근육 세포 (근섬유) fascicules의 그룹에 의해 형성된다. 각각의 근섬유는 정기적으로 반복 조직 수축성 단백질 (액틴과 미오신 필라멘트)로 구성되는 sarcolemma (혈장 막)과 포함 근원 섬유에 의해 둘러싸여 긴 syncytium입니다. 성인의 삶과 휴식 조건에서, 골격 근육은 myonuclei 1의 매우 낮은 회전율을 가지고, 실제로 sarcolemma 아래 근섬유의 주변에 위치하는 myonuclei은, 세포주기의 G0 단계에서 검거 및 1,2- 증식 할 수없는된다.
골격 근육 손상을 따라 서로 밀접하게 관련되어 조직 리모델링 여러 이벤트 후에 항상성 도달 재생하는 독특한 능력을 가지고있다. 급성 손상 또는 외상 후 변성이 유발되어 재생 공정 뒤에근육 세포 집단의 거주자 등 다양한 세포 집단을 포함하는, 상기 위성 세포 SCS (). 실제로, 어떠한 환경 적 자극의 부재 하에서, 위성 셀은 정지 상태에 있고 sarcolemma 상기 기저판 사이에 3,4- 전문 틈새에 위치하고있다. 부상 또는 질병, 활성화, 새로 형성 근섬유 5 상승을주고, 손상된 지역으로 이주, 결국 차별화 확산 될 희주 다음과 같습니다. 활성화 SCS는 외상 6-8의 사이트에서 모집하는 서로 다른 세포 집단, 주로 염증 세포와 크로스 토크 (cross-talk)을 설정합니다. 이 크로스 토크는 세포가 결국 9 항상성 선도 분자 신호 구조 변경을 유도하는 규제 패러다임을 수행 할 수 있습니다. 희주, 염증 및 간질 세포, 혈관 신생 과정 및 재 신경 분포 이벤트 외에도이 높은 조직의 복구를 조율 된 방식으로 행동, 참여pecialized들 구조.
근육의 생리를 이해하고, 또한 전체 공정의 깊은 지식을 필요로 치료 전략을 향상시킬뿐만 아니라, 골격근 재생의 다양한 측면을 연구하는데 관심이있다. 여러 가지 실험 방법은 현재 서로 다른 세포 집단의 신호 경로, 및 관련된 분자 메커니즘의 정체성과 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 급성 손상의 마우스 모델은이 과정의 여러 측면을 조사하는 강력한 도구를 나타냅니다. 다른 일반적으로 급성 근육 손상 연구자 프로세스의 말미에 초기 단계에서, 생체 내에서 재생 공정을 수행 할 수 있도록 유도하는 방법을 사용 하였다. 이 프로토콜은 용해술 유도 및 조직 샘플의 분석까지 재생 공정을 트리거 뱀독 – 유래 cardiotoxin의 근육 내 주사 (CTX)의 단계를 설명한다. CTX 주입 후, 마일CE는 실험 조건에 따라 서로 다른 시점에서 희생 될 수 있고, 골격 근육 해부하고 추가 분석을 위해 처리 될 수있다. 마지막으로, 우리는 기본 형태 학적 관찰과 정량적 분석을 수행하도록 조직 절편의 염색 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 높은 재현성으로 10 생체 내에서 급성 골격 근육 재생의 연구 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here, we describe a protocol to induce acute injury in skeletal muscle (i.e., the intramuscular injection of CTX). It is widely used as a powerful tool to study the dynamics of skeletal muscle regeneration in vivo. CTX injection induces the degeneration of muscle fibers, which is caused by the depolarization of the sarcolemma and the contraction of the fibers12, and triggers the cascade of events that leads to muscle regeneration. Skeletal muscles are dissected at desired time points after th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
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