Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon
Summary
Bu yazıda, yetişkin farelerde ve diseksiyon olarak kasların sonraki manipülasyonlar, dondurma, kesme, rutin boyama ve myofiber kesit alanı analizi akut iskelet kas yenilenmesini meydana ayrıntılı bir protokol açıklamaktadır.
Abstract
İskelet kası yenilenmesi yaralanma ya da hastalık yanıt olarak, yetişkin iskelet kaslarının oluşan bir fizyolojik bir süreçtir. Akut yaralanma kaynaklı iskelet kası rejenerasyon kas rejenerasyonu yanı sıra mekanizmaları ve farklı oyuncular yer alan olayları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir, güçlü modeli sistemidir. Gerçekten de, bu sürecin ayrıntılı bilgi, iskelet kas dejenerasyonu neden patolojik durumların daha iyi anlaşılması için gerekli olan ve yeni hedef tedavi stratejileri belirleme yardımcı olur. Bu çalışma cardiotoxin tek bir intramüsküler enjeksiyon (CTX) aracılığıyla farelerde akut iskelet kas rejenerasyonu ikna etmek için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar. CTX yılan zehiri toksinler ailesine aittir ve sonunda rejenerasyon olaylarını tetikleyen myofibers bir myolysis neden olur. iskelet kası rejenerasyon dinamikleri, kas bölümleri histolojik analizi ile değerlendirilir. ayrıca protokol, Diseksiyon donma ve tibialis anterior kas yanı sıra yaygın sonraki morfolojik ve morfometrik analizi için kullanılan rutin Hematoksilen & Eosin boyama kesmek için deneysel prosedürler göstermektedir.
Introduction
Memeli yetişkin iskelet kas kasılması için özel olan çok çekirdekli kas hücreleri (myofibers) arasında fasiküller grupları ile oluşturulmaktadır. Her myofiber düzenli ve sürekli olarak düzenlenen kontraktil proteinlerin (aktin ve myosin filamanların) oluşur sarcolemma (plazma membran) içeren ve myofibrils çevrili bir ince uzun sinsityum vardır. Erişkin yaşamda ve dinlenme koşullarında, iskelet kasları kendi myonuclei 1 çok düşük bir ciro var; Gerçekten, sarcolemma altında, myofiber çevresinde yer almaktadır myonuclei, hücre döngüsünün G0 fazında tutuklandı ve 1,2 çoğalırlar edemiyoruz vardır.
İskelet kasları, zarar aşağıdaki sıkıca birbirleriyle ilişkili olan doku yeniden birkaç olaylardan sonra homeostazisini ulaşan yeniden özgü yeteneği var. akut yaralanma veya travma sonrasında dejenerasyon, indüklenir yenilenmesi işlemleri ve ardındankas hücrelerinin bir yerleşik nüfusun dahil olmak üzere farklı hücre popülasyonu, içerdiğini, uydu hücreleri (SC'ler). Gerçekten de, bir çevresel uyarıcılar olmadan uydu hücreleri, hareketsiz bir durumda olan sarkolemma ve bazal lamina 3,4 arasında bir niş yer almaktadır. Bir yaralanma ya da hastalık, aktif, yeni şekillendirme myofibers 5 sebebiyet veren, hasar görmüş alanlara göç ve sonunda ayırt çoğaltacak haline AVM ardından. Aktif SC'ler travma 6-8 sitesinde işe farklı hücre popülasyonlarının, temel olarak iltihap hücreleri ile çapraz-kurulması. Bu cross-talk hücreleri sonunda 9 homeostazı lider, moleküler sinyaller yapısal değişiklikler hangi sürücü tarafından düzenlenmiş bir paradigma izlemenizi sağlar. AVM, inflamatuar ve interstisyel hücreler, anjiyojenik süreçler ve yeniden innervasyon etkinliklerin yanı sıra, aynı zamanda bu son derece organize ve s onarmak için koordineli bir şekilde hareket ederek, söz konusupecialized yapısı.
kas fizyolojisini anlamak için değil, aynı zamanda tüm sürecin derin bilgi gerektiren tedavi stratejileri geliştirmek için değil sadece, iskelet kası yenilenme farklı yönlerini inceleyerek büyük ilgi var. Çeşitli deneysel yaklaşımlar günümüzde farklı hücre popülasyonlarının, sinyal yolları ve ilgili moleküler mekanizmaların kimliğini ve işlevini incelemek için kullanılabilir. Akut yaralanma Fare modelleri bu sürecin pek çok yönünü araştırmak için güçlü bir araç temsil etmektedir. Farklı yaygın akut kas hasarı araştırmacılar sürecinin sonuna kadar çok erken aşamalarında, in vivo rejenerasyon sürecini takip etmesine izin ikna etmek için teknikler kullanılır. Bu protokol myolysis uyarır ve doku örneklerinin analizine kadar yenilenme sürecini tetikleyen yılan zehiri türevi cardiotoxin intramüsküler enjeksiyon (CTX), gelen adımları açıklar. CTX enjeksiyonundan sonra, mice deney koşullarına bağlı olarak, farklı zaman noktalarında feda edilebilir ve iskelet kasları parçalara ayrıldı ve daha fazla analiz için işlenebilir. Son olarak, biz morfolojik gözlemler ve temel kantitatif analizleri yapmak için doku bölümleri boyama protokol açıklar. Bu protokol, yüksek ölçüde tekrarlanabilir biçimde 10 in vivo akut iskelet kas rejenerasyon çalışma sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, iskelet kasında (yani, CTX kas içi enjeksiyon) akut hasara yol için bir protokol açıklar. Bu yaygın in vivo iskelet kası yenilenme dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılmaktadır. CTX enjeksiyon sarcolemma bir depolarizasyon ve elyaf 12 kasılması neden olur kas lifleri, yozlaşmasına neden olur ve kas yenilenme yol açan olaylar zincirini tetikler. İskelet kas deney ihtiyaçlarına göre, enjeksiyon ve yaralanma sonrası istenen zaman noktaların…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
