Beredning av Oblique ryggmärgs skivor för ventrala Root Stimulering
Summary
Vi visar hur man förbereder sneda skivor av ryggmärgen hos unga möss. Denna beredning möjliggör för stimulering av de ventrala rötter.
Abstract
Elektrofysiologiska inspelningar från ryggmärgsskivor har visat sig vara en värdefull teknik för att undersöka ett brett spektrum av frågor, från cellulär till nätverksegenskaper. Vi visar hur man förbereder livskraftiga sneda skivor av ryggmärgen av unga möss (P2 – P11). I denna beredning, de motoneuroner behålla sina axoner kommer ut från de ventrala rötter i ryggmärgen. Stimulering av dessa axoner framkallar back-förökningsaktionspotentialer invaderar motoneuron SOMAS och spännande det motoneuron säkerheter i ryggmärgen. Inspelning av antidromic aktionspotentialer är en omedelbar, definitiva och elegant sätt att karakterisera motoneuron identitet, som överträffar andra metoder för identifiering. Vidare stimulerar motoneuron säkerheter är ett enkelt och tillförlitligt sätt att excitera de kollaterala målen för motoneuroner i ryggmärgen, såsom andra motoneuroner eller Renshaw celler. I detta protokoll presenterar vi antidromic inspelningar från motoneuron SOMAS liksom Renshaw cell excitation följd av ventrala roten stimulering.
Introduction
Historiskt sett har motoneuron inspelningar med skarpa elektrod genomfördes in vivo på stora djur, såsom katter eller råttor 1 eller på en isolerad hela ryggmärgen hos möss 2. Framväxten av patch-clamp inspelning teknik under 1980-talet, som kallas för direkt tillgång till motoneuron SOMAS som tätning krävs uppnås under visuell vägledning. Sålunda har ryggmärgen slice förberedelse varit lätt uppnås sedan början av 1990-talet tre. Men tidigt skiva beredning ofta inte tillåta stimulering av ventrala rötter. Så vitt vi vet har endast två studier rapporterade framgångsrik stimulering av ventrala rötter i tvärgående skivor, och ingen erhölls från möss 4,5.
I den här artikeln presenterar vi en teknik för att uppnå livskraftiga ryggmärgs skivor neonatala möss (P2 – P11), i vilken motoneuron poolen behåller sina ventrala roten avgår axoner. Ventileraral rot stimulering utlöser antidromic aktionspotential tillbaka till SOMAS i motoneuron poolen ut från samma ventrala roten. Det exciterar också de motoneuron säkerheter mål, andra motoneurons 6-10 och Renshaw-celler 11-13. Eftersom endast motoneuroner skicka sina axoner ner ventrala rötter, använder vi inspelning av antidromic aktionspotentialer som en enkel och definitiv sätt att physiologicaly identifiera motoneuroner 10.
Förutom att använda potentiellt icke-inclusive eller vilseledande elektrofysiologiska och morfologiska criterions att bekräfta motoneuron identitet, nya studier på ryggmärgen motoneuroner åberopade även tråkiga och tidskrävande efterhand färgningar 16. Sådan identifiering utförs vanligtvis endast på ett urval av de inspelade celler. Andra strategier för identifiering förlitar sig på mus linjer där motoneuroner uttrycker endogena fluorescens <sup> 17-19. Emellertid kan använda genetiskt kodade markörer vara svårt vid en ung ålder när markör uttryck är fortfarande variabel eller om studien kräver redan använder en transgen mus linje. Alternativt kan antidromic aktions potentiella inspelningar utföras rutinmässigt på alla möss från debuten av cell inspelning. Praktiker som arbetar på intakta ryggmärgen förberedelser i katt, råtta och mus, har på ett tillförlitligt sätt använt sådana identifieringstekniker sedan 1950 1,2,20,21. Under optimala förhållanden, kunde vi framkalla antidromic aktionspotentialer från praktiskt taget alla inspelade motorneuron.
Dessutom kan ventrala roten stimulering användas för att tillförlitligt excitera andra motoneuroner 22,23 eller deras mål. de Renshaw-celler 10,24,25. Vi presenterar här tillämpningar av den ventrala roten stimulering i form av antidromic aktions potentiella inspelningar från motoneuron SOMAS, samt excitering av Renshaw-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sned skivning av ryggmärgen är viktigt eftersom det gör det möjligt för ensidig stimulering av motoneuron pooler och Renshaw celler vid en enda vertebral segment på ett tillförlitligt, heltäckande och specifikt sätt. Dessutom gör det möjligt för en snabb, elegant och icke-tvetydig identifiering av inspelade motoneuroner. Därefter kommer vi att lyfta fram fördelarna med denna teknik jämfört med andra metoder skiva beredning, och då kommer vi att betona de vanligaste fallgropar att undvika när de utför …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Marin Manuel och Olivia Goldman-Szwajkajzer för deras hjälp att ta fotografier. Författarna tackar också Arjun Masukar och Tobias Bock för korrekturläsning manuskriptet. Finansiellt stöd tillhandahölls av Agence Nationale pour la Recherche (hyper MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), NIH-NINDS (R01NS077863), den Thierry Latran Foundation (OHEX Project), den franska föreningen för myopati ( licensnummer 16026) och Target ALS är tacksamma. Felix Leroy var mottagare av ett "Contrat Doctoral" från Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
References
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d’Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O’Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d’Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O’Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower’s tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O’Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
