لإعداد المائل الحبل الشوكي شرائح لبطني الجذر تحفيز
Summary
وتبين لنا كيفية تحضير شرائح مائلة من الحبل الشوكي في الفئران الشابة. هذا الإعداد يسمح لتحفيز الجذور البطنية.
Abstract
وقد أثبتت التسجيلات الكهربية من شرائح الحبل الشوكي لتكون تقنية قيمة للتحقيق في مجموعة واسعة من الأسئلة، من الخلوية إلى خصائص الشبكة. وتبين لنا كيفية تحضير شرائح مائلة قابلة للحياة من الحبل الشوكي من الفئران الشابة (P2 – P11). في هذا الإعداد، والعصبونات الحركية تحتفظ المحاور التي تخرج من الجذور البطنية من النخاع الشوكي. تحفيز هذه المحاور يثير-نشر يعود إمكانات العمل غزو somas العصبون الحركي ومثيرة الضمانات والعصبون الحركي داخل الحبل الشوكي. تسجيل امكانات العمل معاكسة للمسيرة هو وسيلة فورية، نهائية وأنيقة لتوصيف هوية العصبون الحركي، والذي يتجاوز أساليب هوية أخرى. وعلاوة على ذلك، وحفز الضمانات العصبون الحركي هو وسيلة بسيطة وموثوق بها لإثارة أهداف ضمانات من العصبونات الحركية في النخاع الشوكي، مثل العصبونات الحركية أو R أخرىenshaw الخلايا. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم التسجيلات معاكسة للمسيرة من العصبون الحركي somas وكذلك رينشو إثارة الخلية، الناجم عن التحفيز الجذر البطني.
Introduction
تاريخيا، أجريت التسجيلات العصبون الحركي باستخدام حاد الكهربائي في الجسم الحي على الحيوانات الكبيرة مثل القطط والفئران 1 أو على الحبل الشوكي كله معزولة في الفئران 2. ودعا الوصول المباشر إلى العصبون الحركي ظهور تقنية تسجيل التصحيح، المشبك خلال 1980s، somas كما الختم اللازمة لتحقيقها تحت التوجيه البصري. وهكذا، تم تحقيق الشوكي إعداد الحبل شريحة بسهولة منذ أوائل 1990s 3. ومع ذلك، إعداد شريحة في وقت مبكر في كثير من الأحيان لا تسمح لتحفيز الجذور البطنية. إلى علمنا، وذكرت اثنين فقط من الدراسات التحفيز الناجح لجذور بطني في شرائح عرضية، وتم الحصول على أي من الفئران 4،5.
في هذه المقالة نقدم تقنية لتحقيق شرائح الحبل الشوكي قابلة للحياة الفئران حديثي الولادة (P2 – P11) الذي تجمع العصبون الحركي يحتفظ الجذر المغادرين المحاور في بطني. منفسالتحفيز الجذرية راؤول يطلق إمكانات العمل معاكسة للمسيرة العودة الى somas تجمع العصبون الحركي تخرج من نفس الجذر البطني. لأنه يثير أيضا الأهداف ضمانات العصبون الحركي، العصبونات الحركية الأخرى 6-10 والخلايا رينشو 11-13. منذ العصبونات الحركية فقط ترسل المحاور إلى أسفل جذور بطني، ونحن نستخدم تسجيل إمكانات العمل معاكسة للمسيرة باعتبارها وسيلة بسيطة ونهائية لphysiologicaly تحديد العصبونات الحركية 10.
بالإضافة إلى استخدام معيارا الكهربية والمورفولوجية يحتمل أن تكون غير شاملة أو مضللة لتأكيد هوية العصبون الحركي، اعتمدت الدراسات التي أجريت مؤخرا على العصبونات الحركية في النخاع الشوكي أيضا على مملة ومضيعة للوقت اللاحق stainings 16. عادة ما يتم إجراء هذا التحديد فقط على عينة من الخلايا المسجلة. تعتمد استراتيجيات هوية أخرى على خطوط الماوس فيه العصبونات الحركية تعبر عن مضان الذاتية <sup> 17-19. ومع ذلك، باستخدام علامات المشفرة وراثيا قد يكون من الصعب في سن مبكرة عندما التعبير علامة لا يزال متغير أو إذا اقتضت الدراسة بالفعل باستخدام خط الماوس المعدلة وراثيا. بدلا من ذلك، عمل معاكس للمسيرة التسجيلات المحتملة يمكن أن يؤديها بشكل روتيني على جميع الفئران من بداية تسجيل الخلية. المجربون العمل على الاستعدادات الحبل الشوكي سليمة في القط، الجرذان والفئران، وقد استخدمت هذه التقنيات بشكل موثوق هوية منذ عام 1950 1،2،20،21. في الظروف المثلى، تمكنا من انتزاع امكانات العمل معاكسة للمسيرة من تقريبا كل من العصبونات الحركية المسجلة.
وعلاوة على ذلك، وتحفيز جذر بطني يمكن استخدامها لإثارة موثوق العصبونات الحركية الأخرى 22،23 أو أهدافها. الخلايا رينشو 10،24،25. نقدم هنا تطبيقات التحفيز الجذر البطني في شكل عمل معاكس للمسيرة التسجيلات المحتملة من somas العصبون الحركي، فضلا عن إثارة الخلايا رينشو.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشريح منحرف من الحبل الشوكي هو مهم لأنه يسمح لتحفيز جانب واحد من حمامات العصبون الحركي والخلايا رينشو في الجزء الفقري واحد بطريقة موثوقة وشاملة ومحددة. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لتحديد سريع، أنيق وغير ملتبس من العصبونات الحركية المسجلة. المقبل، ونحن سوف تسلط الضوء ع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر مارين مانويل وأوليفيا غولدمان Szwajkajzer لمساعدتهم في اتخاذ الصور. أشكر الكتاب أيضا أرجون Masukar وتوبياس بوك لتنقيح الكتابة المخطوطة. وقدمت الدعم المالي من قبل الوكالة الوطنية من أجل لا بحوث (HYPER-الفرقة المتعددة الجنسيات، وكالة الاستخبارات الوطنية-2010-بلان-1429-1401)، والمعاهد الوطنية للصحة NINDS (R01NS077863)، ومؤسسة لاتران تييري (مشروع OHEX)، والجمعية الفرنسية لاعتلال عضلي ( منحة رقم 16026)، والهدف ALS وامتنان. وكان فيليكس ليروي المستفيد من "Contrat الدكتوراه" من مدرسة المعلمين العليا، كاشان.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
References
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d’Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O’Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d’Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O’Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower’s tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O’Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
