उदर रूट उत्तेजना के लिए परोक्ष स्पाइनल कॉर्ड स्लाइस की तैयारी
Summary
हम कैसे युवा चूहों में रीढ़ की हड्डी के परोक्ष स्लाइस तैयार करने के लिए दिखा। यह तैयारी उदर जड़ों की उत्तेजना के लिए अनुमति देता है।
Abstract
रीढ़ की हड्डी की स्लाइस से electrophysiological रिकॉर्डिंग एक महत्वपूर्ण तकनीक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए नेटवर्क गुण के लिए सेलुलर से साबित किया है। हम कैसे युवा चूहों (- P11 p2) की रीढ़ की हड्डी के व्यवहार्य परोक्ष स्लाइस तैयार करने के लिए दिखा। इस तैयारी में, motoneurons उनके axons रीढ़ की हड्डी के उदर जड़ों से बाहर आ बरकरार रहती है। इन axons की उत्तेजना वापस प्रचार कार्रवाई क्षमता रीढ़ की हड्डी के भीतर motoneuron somas और रोमांचक motoneuron कोलैटरल हमलावर elicits। antidromic कार्रवाई क्षमता की रिकॉर्डिंग motoneuron पहचान है, जो अन्य पहचान तरीकों से बढ़कर चिह्नित करने के लिए एक तत्काल निश्चित और सुंदर तरीका है। इसके अलावा, motoneuron कोलैटरल उत्तेजक जमानत के इस तरह के अन्य motoneurons या आर के रूप में रीढ़ की हड्डी के भीतर motoneurons के लक्ष्य, उत्तेजित करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका हैकोशिकाओं enshaw। इस प्रोटोकॉल में, हम motoneuron somas के साथ ही रेंशाव सेल उत्तेजना से antidromic रिकॉर्डिंग मौजूद है, उदर जड़ उत्तेजना से उत्पन्न।
Introduction
ऐतिहासिक, तेज इलेक्ट्रोड का उपयोग motoneuron रिकॉर्डिंग बिल्लियों या चूहों के रूप में 1 या 2 चूहों में एक अलग पूरे रीढ़ की हड्डी पर बड़े जानवरों पर विवो में आयोजित की गई। 1980 के दशक के दौरान पैच दबाना रिकॉर्डिंग तकनीक के उद्भव, somas के रूप में सीलिंग की जरूरत motoneuron तक सीधी पहुंच के लिए कहा जाता है दृश्य मार्गदर्शन के तहत प्राप्त किया जा सके। इस प्रकार, रीढ़ की हड्डी टुकड़ा तैयारी आसानी से 1990 के दशक के बाद से 3 हासिल किया गया है। हालांकि, जल्दी टुकड़ा तैयारी अक्सर उदर जड़ों की उत्तेजना के लिए अनुमति नहीं दी। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, केवल दो अध्ययनों अनुप्रस्थ स्लाइस में उदर जड़ों के सफल उत्तेजना को सूचित किया है, और कोई भी चूहों 4,5 से प्राप्त हुई थी।
(- P11 p2) जिसमें motoneuron पूल अपने उदर जड़ प्रस्थान एक्सोन को बरकरार रखे हुए इस लेख में हम नवजात चूहों की व्यवहार्य रीढ़ की हड्डी की स्लाइस को प्राप्त करने के लिए एक तकनीक मौजूद है। बाहर निकलने देनाRAL जड़ उत्तेजना motoneuron पूल में एक ही उदर जड़ से बाहर निकलने की somas में वापस antidromic संभावित कार्रवाई हो सके। यह भी motoneuron जमानत के लक्ष्य, अन्य motoneurons 6-10 और 11-13 रेंशाव कोशिकाओं उत्तेजित। चूंकि केवल motoneurons उनके axons नीचे उदर जड़ों भेजें, हम motoneurons 10 की पहचान physiologicaly करने के लिए एक सरल और निश्चित तरीके के रूप में antidromic कार्रवाई क्षमता की रिकॉर्डिंग का उपयोग करें।
Motoneuron पहचान की पुष्टि करने के लिए संभावित गैर-समावेशी या भ्रामक electrophysiological और रूपात्मक criterions उपयोग करने के अलावा, रीढ़ की हड्डी motoneurons पर हाल के अध्ययनों से भी कठिन और समय लेने वाली पोस्ट अस्थायी stainings 16 पर भरोसा किया। इस तरह की पहचान आमतौर पर ही दर्ज की कोशिकाओं का एक नमूना पर किया जाता है। अन्य पहचान रणनीतियों माउस लाइनों जिसमें motoneurons अंतर्जात प्रतिदीप्ति व्यक्त करने पर भरोसा करते हैं <sup> 17-19। हालांकि, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग मार्कर का उपयोग कम उम्र में मुश्किल हो सकता है जब मार्कर अभिव्यक्ति अभी भी चर रहा है या अध्ययन पहले से ही एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन का उपयोग की आवश्यकता है। वैकल्पिक रूप से, antidromic संभावित कार्रवाई रिकॉर्डिंग सेल रिकॉर्डिंग की शुरुआत से सभी चूहों पर नियमित रूप से किया जा सकता है। बिल्ली, चूहा और माउस में बरकरार रीढ़ की हड्डी की तैयारी पर काम कर प्रयोगकर्ता, मज़बूती से 1950 के बाद से इस तरह 1,2,20,21 पहचान की तकनीक का इस्तेमाल किया है। इष्टतम स्थितियों में, हम दर्ज की motoneurons के लगभग सभी से antidromic कार्रवाई क्षमता को प्रकाश में लाना करने में सक्षम थे।
इसके अलावा, उदर जड़ उत्तेजना मज़बूती अन्य motoneurons 22,23 या अपने लक्ष्य को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रेंशाव कोशिकाओं 10,24,25। हम यहाँ motoneuron somas से antidromic संभावित कार्रवाई रिकॉर्डिंग के रूप में उदर जड़ उत्तेजना के आवेदन पत्र, साथ ही रेंशाव कोशिकाओं की उत्तेजना प्रस्तुत करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्योंकि यह एक विश्वसनीय, व्यापक और विशिष्ट तरीके से एक भी कशेरुकी खंड पर motoneuron पूल और रेंशाव कोशिकाओं की एकतरफा उत्तेजना के लिए अनुमति देता है रीढ़ की हड्डी के तिर्यक टुकड़ा करने की क्रिया के लिए महत्वप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों तस्वीरें लेने में उनकी मदद के लिए मारिन मैनुअल और ओलिविया गोल्डमैन-Szwajkajzer धन्यवाद। लेखकों को भी पांडुलिपि proofreading के लिए अर्जुन Masukar और टोबियास बोक धन्यवाद। वित्तीय समर्थन एजेसीं नेशनल द्वारा प्रदान किया गया ला Recherche (हाइपर-MND, ANR-2010-blan-1429-01) डालना, एनआईएच-NINDS (R01NS077863), थियरी Latran फाउंडेशन (OHEX परियोजना), मायोपथी के लिए फ्रेंच एसोसिएशन ( अनुदान संख्या 16026) और लक्ष्य ए एल एस आभार स्वीकार कर रहे हैं। फेलिक्स लेरॉय इकोले नॉर्मले Supérieure, Cachan से एक "Contrat डॉक्टरेट" से सम्मानित किया गया।
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
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