Utarbeidelse av Oblique Spinal Cord Slices for Ventralt Root Stimulering
Summary
Vi viser hvordan du kan forberede skrå skiver av ryggmargen hos unge mus. Dette preparatet gir mulighet for stimulering av de ventrale røttene.
Abstract
Elektro opptak fra ryggmargs skiver har vist seg å være en verdifull teknikk for å undersøke et bredt spekter av spørsmål, fra mobilnettet til nettverksegenskaper. Vi viser hvordan du forbereder levedyktige skrå skiver av ryggmargen av unge mus (P2 – P11). I dette preparatet, de motoneurons beholde sine aksoner kommer ut fra ventrale røttene i ryggmargen. Stimulering av disse axoner utløser back-forplanter aksjonspotensialer invaderer motoneuron Somas og spennende den motoneuron collaterals i ryggmargen. Opptak av antidromic aksjonspotensialer er en umiddelbar, definitive og elegant måte å karakterisere motoneuron identitet, som overgår andre identifikasjonsmetoder. Videre stimulere motoneuron collaterals er en enkel og pålitelig måte å opphisse sikkerhet målene for motoneurons i ryggmargen, for eksempel andre motoneurons eller Renshaw celler. I denne protokollen, presenterer vi antidromic opptak fra motoneuron Somas samt Renshaw celle eksitasjon, som følge av ventral rot stimulering.
Introduction
Historisk sett ble motoneuron opptak med skarp-elektrode utført in vivo på store dyr som katter eller rotter 1 eller på en isolert hele ryggmargen hos mus 2. Fremveksten av patch-clamp opptaksteknikk på 1980-tallet, kalt for direkte tilgang til motoneuron Somas som forsegling måtte oppnås under visuell veiledning. Dermed har ryggmargen skive forberedelse er lett oppnådd siden tidlig på 1990-tallet tre. Men tidlig skive forberedelse ofte ikke tillate for stimulering av ventrale røttene. Så langt vi kjenner til, har bare to studier har rapportert vellykket stimulering av ventrale røtter i tverr skiver, og ingen ble innhentet fra mus 4,5.
I denne artikkelen presenterer vi en teknikk for å oppnå levedyktige ryggmargs skiver av neonatal mus (P2 – P11) hvor motoneuron bassenget beholder sine ventral rot avgang aksoner. Ventral root stimulering utløser antidromic aksjonspotensial tilbake til Somas av motoneuron bassenget spennende fra samme ventral roten. Det interesserer også motoneuron sivile mål, andre motoneurons 6-10 og Renshaw celler 11-13. Siden bare motoneurons sender sine aksoner ned ventrale røttene, bruker vi innspillingen av antidromic aksjonspotensialer som en enkel og definitive måten å, fysiologisk identifisere motoneurons 10.
I tillegg til å bruke potensielt ikke-inkluderende eller villedende elektrofysiologiske og morfologiske kriterier for å bekrefte motoneuron identitet, nyere studier på ryggmargs motoneurons også støttet seg på kjedelig og tidkrevende post hoc stainings 16. Slik identifisering er vanligvis utføres bare på et utvalg av de registrerte celler. Andre identifikasjonsstrategier stole på mus linjer der motoneurons uttrykker endogen fluorescens <sup> 17-19. Men ved å bruke genetisk kodet markører kan være vanskelig i ung alder når markør uttrykk er fortsatt variabel eller hvis studien allerede krever bruk av en transgen muselinje. Alternativt kan antidromic aksjonspotensial-opptak utføres rutinemessig på alle musene fra angrep av celle-opptak. Forskere som arbeider med intakte ryggmargs preparater i katt, rotte og mus, har sikkert brukt slike identifikasjonsteknikker siden 1950 1,2,20,21. Under optimale forhold, var vi i stand til å lokke fram antidromic aksjonspotensialer fra nesten alle de registrerte motoneurons.
Videre kan ventral rot stimulering brukes til pålitelig opphisse andre motoneurons 22,23 eller sine mål. The Renshaw celler 10,24,25. Vi presenterer her anvendelser av den ventrale rot stimuleringen i form av antidromic virkningspotensialet opptak fra motoneuron Somas, samt eksitasjon av Renshaw-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skrå kutting av ryggmargen er viktig fordi det gjør det mulig for ensidig stimulering av motoneuron bassenger og Renshaw-celler ved en enkelt ryggvirvel segment i en pålitelig og omfattende og spesifikk måte. Videre gir det mulighet for en rask, elegant og ikke-tvetydig identifikasjon av innspilte motoneurons. Deretter vil vi fremheve fordelene med denne teknikken i forhold til andre skive tilberedningsmetoder, og da vil vi understreke ut de vanligste fallgruvene å unngå mens du utfører denne prosedyren.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Marin Manuel og Olivia Goldman-Szwajkajzer for deres hjelp i å ta bilder. Forfatterne takker også Arjun Masukar og Tobias Bock for korrekturlesing av manuskriptet. Finansielle støtter ble gitt av Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), NIH-ninds (R01NS077863), Thierry Latran Foundation (OHEX Project), den franske foreningen for myopati ( tilskuddet nummer 16026) og Target ALS er takknemlig erkjent. Felix Leroy var mottakeren av en "Contrat Doctoral" fra Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
References
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d’Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O’Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d’Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O’Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower’s tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O’Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
