Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,<em> Middellandse-Zeevlieg</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
De Mediterrane fruitvlieg (medfly) Middellandse-Zeevlieg (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is een schadelijke soorten met een extreem hoge agrarische relevantie. Dit is te wijten aan het voortplantingsgedrag: vrouwtjes schade aan de buitenkant van groenten en fruit als ze eieren en de larven voeden zich met hun pulp te leggen. Wild C. capitata populaties zijn traditioneel gecontroleerd door middel van insecticide sproeien en / of eco-vriendelijke benadering, de meest succesvolle zijn de Steriele Insect Techniek (SIT). Het SIT is gebaseerd op massa-fokken, straling gebaseerde sterilisatie en veld vrijlating van de mannen die hun vermogen om te paren te behouden, maar zijn niet in staat om vruchtbaar nageslacht te genereren. De komst en de daaropvolgende snelle ontwikkeling van biotechnologische hulpmiddelen, evenals de beschikbaarheid van de medfly genoomsequentie, sterk gestimuleerd ons begrip van de biologie van deze soort. Dit voordeel van de proliferatie van nieuwe strategieën voor genoom manipulatie, die can worden toegepast controlepopulatie.
In deze context, embryo micro-injectie speelt een dubbele rol in de uitbreiding van de toolbox voor medfly controle. Het vermogen om te interfereren met de functie van genen die belangrijke biologische processen reguleren inderdaad vergroot ons begrip van de moleculaire machinerie onderliggende medfly invasiviteit. Bovendien de mogelijkheid om kiemlijn transformatie te bereiken maakt de productie van meerdere transgene stammen die kunnen worden getest voor toekomstige veldtoepassingen in nieuwe SIT instellingen. Inderdaad, kan genetische manipulatie worden gebruikt om gewenste eigenschappen die kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om steriele mannelijke prestaties in het veld te verlenen, of die leiden tot vroege levensfase letaliteit. Hier beschrijven we een methode om nucleïnezuren microinject in medfly embryo's van deze twee belangrijke doelen te bereiken.
Introduction
De Mediterrane fruitvlieg (medfly) Middellandse-Zeevlieg is een kosmopolitische soort die op grote schaal schade fruit en cultuurgewassen. Het behoort tot de familie Tephritidae, die verschillende soorten ongedierte, zoals die welke behoren tot de geslachten Bactrocera en Anastrepha omvat. De medfly is de meest bestudeerde soorten van deze familie, en het heeft een model niet alleen voor de studie van insecten invasies 1, maar ook voor het optimaliseren gewasbeschermingstrategieën 2 geworden.
De medfly is een multivoltine soort die kan aanvallen meer dan 300 soorten wilde en gekweekte planten 3,4. De schade wordt veroorzaakt door zowel de volwassenen als de larvale stadia: bevruchte vrouwtjes doorboren het oppervlak van de vrucht voor het leggen van eitjes, waardoor micro-organismen om hun commerciële kwaliteit beïnvloeden, terwijl de larven voeden zich met het vruchtvlees. Na drie larvale stadia, larven van de gastheer en verpoppen in de bodem. Ceratitiscapitata toont een bijna wereldwijde distributie, met inbegrip van Afrika, het Midden-Oosten, West-Australië, Midden- en Zuid-Amerika, Europa en delen van de Verenigde Staten 5.
De meest voorkomende strategieën te beperken medfly parasitaire aandoeningen gepaard met het gebruik van insecticiden (bijv Malathion, spinosad) en de milieuvriendelijke Steriele Insect Techniek (SIT) 6. De laatste benadering betreft de introductie in het wild van honderdduizenden mannen gemaakt steriel door blootstelling aan ioniserende straling. Het koppelen van dergelijke gesteriliseerde mannetjes wild vrouwtjes resulteert in geen nageslacht, waardoor een verkleining populatie, uiteindelijk leidend tot uitroeiing. Hoewel SIT effectief in meerdere campagnes wereldwijd heeft bewezen, haar belangrijkste nadelen zijn de hoge kosten van het grootbrengen en steriliseren miljoenen insecten worden vrijgegeven. Markering van de vrijgelaten personen is noodzakelijk om onderscheid te maken steriele van wilde insecten gevangen in het gebied tijdenstoezicht op de activiteiten en het wordt momenteel bereikt met behulp van fluorescerende poeders. Deze procedures zijn duur en ongewenste neveneffecten 7.
Om te optimaliseren en / of effectievere aanpak voor de bestrijding van deze plagen te ontwikkelen, hebben medfly biologie en genetica grote schaal onderzocht door vele onderzoekers wereldwijd. De beschikbaarheid van de genoomsequentie 8,9 medfly zullen nieuwe onderzoeken naar genfuncties vergemakkelijken. RNA-interferentie is een krachtig hulpmiddel voor dergelijke studies en kan worden bereikt door de micro-injectie van dsRNA (dubbelstrengs RNA) of siRNA (kleine interfererende RNA). Deze techniek is gebruikt, bijvoorbeeld aantonen dat de geslachtsbepaling moleculaire cascade in C. capitata slechts gedeeltelijk geconserveerd ten opzichte van die van Drosophila 10.
De ontwikkeling van protocollen bij medfly embryo's toegestaan C. microinject capitata de eerste niet zijn-Drosophilid Fly soorten genetisch te modificeren. Zoals de eieren zijn vergelijkbaar met die van Drosophila, zowel qua morfologie en weerstand tegen uitdroging 11 het protocol om plasmide DNA te leveren in pre-embryo blastoderm eerst ontwikkeld D. melanogaster 12,13 werd aanvankelijk aangepast voor gebruik in C. capitata. Deze eerste experimenten toegestaan medfly kiemlijn transformatie op basis van het transponeerbare element Minos 11. Vervolgens werd het oorspronkelijke systeem gemodificeerde 14 op andere transposon gebaseerde benaderingen. Dit is het geval van piggyBac van de Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Het protocol is inmiddels verder geoptimaliseerd en dit heeft de transformatie van andere Tephritid soorten 16-21 en ook van vele andere Diptera 22-31 toegestaan. Al deze systemen zijn gebaseerd op het gebruik van een typische binaire vector / helper plasmide transformatiesysteem: kunstmatige defecte transpozonen die gewenste genen worden samengevoegd in plasmide-DNA en in het genoom van het insect geïntegreerde, door in de transposase enzym 32. Een aantal transgene medfly lijnen werden gegenereerd, met meerdere functies, waaronder stammen die een conditionele dominant letale gen dat letaliteit induceert, stammen die alleen mannen nageslacht en dus zonder eigen extra sexing strategieën en stammen met fluorescerende sperma, die de nauwkeurigheid kunnen versterken van het SIT toezichtsfase 33-37. Hoewel de inbreng in het wild transgene organismen opgetreden in piloottesten tegen muggen slechts 38,39, ten minste één onderneming evalueren van een aantal transgene stammen medfly voor het gebruik in het veld 40.
Embryo micro-injectie kan ook voorstander van de ontwikkeling van nieuwe genoom-editing tools, zoals transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens), geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom herhalingen (CRISPR) / CRISPR geassocieerd eiwit 9 nuclease (Cas9) en homing endonucleases genen (HEGS), die nieuwe evolutionaire en ontwikkelingsstudies in staat zal stellen, alsook de uitbreiding van de beschikbare biotechnologische gereedschapskist. Genoom-editing benaderingen al kon de generatie van gen-aandrijfsystemen in muggen 41, en hun overdracht aan de medfly staat voor de deur. Hier beschrijven we een algemeen protocol voor microinjecting nucleïnezuren in medfly embryo's die nuttig kunnen zijn voor alle bovengenoemde toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Micro-injectie van nucleïnezuren in insectencellen embryo is een universele techniek die zowel de analyse van genfuncties en biotechnologische toepassingen vergemakkelijkt.
De recente publicatie van de genoomsequenties van steeds insectensoorten leidt tot een dringende behoefte aan instrumenten voor de functionele karakterisering van genen van nog onbekende functie. RNA-interferentie heeft bewezen een van de meest waardevolle methoden om moleculaire functies 49 afleiden en embryo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
References
- Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
- Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
- Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
- Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
- Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
- Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. . Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , (2005).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016)
- Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
- Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Hoy, M. . Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , (2013).
- Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
- Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
- Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
- Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
- Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
- Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
- Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
- Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
- Allen, M. L., O’Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
- Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
- Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
- Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
- Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
- Takken, W., Scott, T. W. . Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , (2003).
- Handler, A. M., Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , 3-26 (2000).
- Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
- Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
- Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
- Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
- Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
- Gilbert, L. . Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , (2009).
- Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A., Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. . Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. , 85-93 (2007).
- Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
- Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F., Benedict, M. Q. . Transgenic insects: techniques and applications. , 188-207 (2014).
- Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, S11 (2014).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
