Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em> Ceratitis capitata</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
La mosca mediterránea de la fruta (mosca de la fruta) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) es una especie de plaga con extremadamente alta relevancia agrícola. Esto es debido a su comportamiento reproductivo: las hembras dañan la superficie externa de las frutas y verduras cuando se ponen los huevos y las larvas se alimentan tramado en su pulpa. Salvaje C. poblaciones capitata se controlan tradicionalmente a través de la aplicación de insecticidas y / o enfoques ecológicos, siendo el más exitoso de la técnica del insecto estéril (TIE). El SIT se basa en la cría en masa, la esterilización basada en la radiación y la liberación campo de los hombres que retienen su capacidad para aparearse pero no son capaces de generar progenie fértil. El advenimiento y la subsiguiente rápido desarrollo de herramientas biotecnológicas, junto con la disponibilidad de la secuencia del genoma de la mosca mediterránea, ha impulsado en gran medida nuestra comprensión de la biología de esta especie. Esto favoreció la proliferación de nuevas estrategias para la manipulación del genoma, que can aplicarse a control de la población.
En este contexto, la microinyección de embriones juega un doble papel en la expansión de la caja de herramientas para el control de la mosca mediterránea. La capacidad de interferir con la función de los genes que regulan los procesos biológicos claves, en efecto, expande nuestra comprensión de la maquinaria molecular que subyace a la invasividad de moscamed. Además, la capacidad para lograr la transformación de la línea germinal facilita la producción de múltiples cepas transgénicas que pueden ser probados para futuras aplicaciones en el campo de nuevos ajustes SIT. De hecho, la manipulación genética se puede utilizar para conferir rasgos deseables que pueden, por ejemplo, ser utilizados para monitorear el desempeño de los machos estériles en el campo, o que puede dar lugar a letalidad primeras fases de vida. Aquí se describe un método para microinyectar ácidos nucleicos en embriones de mosca mediterránea de alcanzar estos dos objetivos principales.
Introduction
La mosca mediterránea de la fruta (mosca de la fruta) Ceratitis capitata es una especie cosmopolita que daña ampliamente frutas y cultivos. Pertenece a la familia Tephritidae, que incluye varias especies de plagas, tales como los pertenecientes a los géneros Bactrocera y Anastrepha. La mosca de la fruta es la especie más estudiada de esta familia, y se ha convertido en un modelo no sólo para el estudio de las invasiones de insectos 1, sino también para la optimización de las estrategias de control de plagas 2.
La mosca de la fruta es una especie multivoltina que pueden atacar a más de 300 especies de plantas silvestres y cultivadas 3,4. El daño es causado tanto por los adultos y los estadios larvarios: hembras apareadas perforan la superficie de la fruta para la oviposición, permitiendo que los microorganismos que afectan su calidad comercial, mientras que las larvas se alimentan de la pulpa de la fruta. Después de tres etapas larvales, las larvas emergen desde el host y se transforman en crisálidas en el suelo. Ceratitiscapitata muestra una distribución casi todo el mundo, incluyendo África, Oriente Medio, Australia Occidental, América Central y del Sur, Europa, y las áreas de los Estados Unidos 5.
Las estrategias más comunes para limitar las infestaciones de mosca mediterránea implican el uso de insecticidas (por ejemplo, malatión, Spinosad) y la técnica del insecto estéril con el medio ambiente (SIT) 6. El último enfoque implica la liberación en el medio natural de cientos de miles de machos estériles prestados por la exposición a la radiación ionizante. El acoplamiento de tales machos esterilizados a hembras silvestres da lugar a ninguna progenie, causando una reducción en tamaño de la población, llevando eventualmente a la erradicación. Aunque SIT ha demostrado su eficacia en múltiples campañas en todo el mundo, sus principales desventajas incluyen los altos costos de la crianza y la esterilización de millones de insectos para ser lanzado. Marcado de los individuos liberados es necesario distinguir estéril de los insectos salvajes capturados en el campo duranteseguimiento de las actividades y en la actualidad se consigue utilizando polvos fluorescentes. Estos procedimientos son costosos y tienen efectos secundarios indeseables 7.
Con el fin de optimizar y / o para desarrollar enfoques más eficaces para el control de esta plaga, la biología y la genética mosca de la fruta han sido ampliamente explorado por numerosos investigadores de todo el mundo. La disponibilidad de la secuencia del genoma de moscamed 8,9, facilitará nuevas investigaciones sobre funciones de genes. La interferencia de ARN es una poderosa herramienta para tales estudios y se puede lograr a través de la microinyección de dsRNA (RNA de doble cadena) o siRNA (ARN interferente pequeño). Esta técnica se ha utilizado, por ejemplo, para demostrar que la cascada molecular determinación del sexo en C. capitata se conserva sólo en parte con respecto a la de Drosophila 10.
El desarrollo de protocolos para microinyectar embriones de mosca mediterránea permitidos C. capitata para ser el primer noespecies de moscas -Drosophilid a ser modificados genéticamente. Como sus huevos son similares a las de Drosophila, tanto en términos de morfología y la resistencia a la desecación 11, el protocolo para administrar ADN de plásmido en los embriones pre-blastoderm desarrollados primero por D. 12,13 melanogaster fue adaptado inicialmente para su uso en C. capitata. Estos primeros experimentos permitieron la transformación de la línea germinal mosca mediterránea basada en el elemento de transposición Minos 11. Posteriormente, el sistema original fue modificado 14 usando otros enfoques basados en transposón. Este es el caso de piggyBac de los lepidópteros Trichoplusia ni 15. El protocolo ya ha sido optimizado, lo que ha permitido la transformación de otras especies -tephritidae- 16-21 y también de muchos otros dípteros 22-31. Todos estos sistemas se basan en el uso de un sistema de transformación de plásmido binario típico vector / ayudante: artificial, transpo defectuosohijos que contienen los genes deseados se ensamblan en el ADN plásmido y se integran en el genoma del insecto mediante el suministro de la enzima transposasa 32. Una serie de líneas de mosca mediterránea transgénicas se han generado, con múltiples funciones que incluyen cepas que portan un gen letal dominante condicional que induce letalidad, cepas que producen sólo para hombres progenie y lo que no requiere de estrategias de sexado adicionales, y las cepas con espermatozoides fluorescente, lo que puede aumentar la precisión de la fase de seguimiento SIT 33-37. A pesar de la liberación en el medio natural de los organismos transgénicos se ha producido en las pruebas piloto contra los mosquitos solamente 38,39, al menos una compañía está evaluando una serie de cepas de mosca mediterránea transgénicos para su uso en el campo 40.
microinyección de embriones también puede favorecer el desarrollo de nuevas herramientas de edición de genoma, tales como nucleasas de transcripción activador de efectores (Talens), agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / CRISPR proteína asociada 9 nucleasa (Cas9) y la vivienda de endonucleasas genes (HEGs), lo que permitirá nuevos estudios evolutivos y de desarrollo, así como la expansión de la caja de herramientas biotecnológicas disponibles. Enfoques de edición de genoma que ya permitió la generación de sistemas de genes sin conductor en mosquitos 41, y su transferencia a la mosca de la fruta es inminente. Aquí se describe un protocolo universal para la microinyección de ácidos nucleicos en embriones de mosca mediterránea que pueden ser útiles para todas las aplicaciones antes mencionadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microinyección de ácidos nucleicos en embriones de insectos es una técnica universal que facilita tanto el análisis de la función génica y aplicaciones biotecnológicas.
La reciente publicación de las secuencias del genoma de un número creciente de especies de insectos conduce a una necesidad urgente de herramientas para la caracterización funcional de los genes de función aún desconocida. La interferencia del ARN ha demostrado ser uno de los métodos más valiosos para inferir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
References
- Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
- Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
- Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
- Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
- Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
- Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. . Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , (2005).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016)
- Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
- Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Hoy, M. . Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , (2013).
- Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
- Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
- Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
- Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
- Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
- Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
- Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
- Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
- Allen, M. L., O’Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
- Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
- Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
- Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
- Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
- Takken, W., Scott, T. W. . Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , (2003).
- Handler, A. M., Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , 3-26 (2000).
- Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
- Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
- Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
- Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
- Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
- Gilbert, L. . Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , (2009).
- Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A., Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. . Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. , 85-93 (2007).
- Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
- Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F., Benedict, M. Q. . Transgenic insects: techniques and applications. , 188-207 (2014).
- Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, S11 (2014).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
