L'identificazione di piccole proteine che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
piccole molecole bioattive fondamentalmente funzionano interagendo ed alterare la funzione di uno o più molecole "target", più comunemente proteine, nella cellula. In scoperta di farmaci, quando un composto attivo viene scoperto attraverso lo screening fenotipico, identificazione del bersaglio molecolare (s) di detto composto è cruciale, non solo per la comprensione del meccanismo di azione e potenziali effetti collaterali del composto, ma anche per potenzialmente scoprire nuova biologia alla base del modello di malattia e aprendo la strada allo sviluppo di nuove classi meccanicistiche terapie in 1. Anche se l'identificazione di destinazione non è richiesta per un farmaco da utilizzare terapeuticamente, negli ultimi anni c'è stato un crescente riconoscimento del fatto che nuovi farmaci candidati hanno maggiori probabilità di avere successo negli studi clinici, e quindi produrre rendimenti migliori degli investimenti, se un bersaglio convalidato è noto 2. Così, c'è stato un crescente interesse metodi per identificare piccoleproteine bersaglio molecola.
Un esperimento di identificazione di destinazione classica si basa in genere su purificazione di affinità, dove la piccola molecola di interesse è immobilizzato su una resina e incubato con lisati cellulari integrali, dopo di che le proteine non legate vengono spazzati via e le restanti proteine vengono eluite e identificati 3. Sebbene questa tecnica è stata utilizzata per identificare i bersagli di molte piccole molecole 4, è idoneo come metodo ID destinazione universale per diversi motivi. Innanzitutto, la proteina bersaglio deve mantenere la sua conformazione nativa upon lisi cellulare al fine di mantenere la sua capacità di legarsi alla piccola molecola. Questo può essere particolarmente problematico per proteine di membrana, che spesso subiscono cambiamenti conformazionali dopo essere stato rimosso dal loro ambiente nativo, o semplicemente aggregata e precipitano dalla soluzione. In secondo luogo, la piccola molecola deve essere modificata chimicamente in modo tale che esso può essere immobilizzato sulla resina mantenendosua capacità di legare la proteina bersaglio. tasche vincolanti profondi possono pertanto diventare inaccessibile a una piccola molecola una volta che è fissato alla resina. In terzo luogo, l'affinità di legame deve essere sufficientemente elevata che l'interazione viene mantenuta durante le fasi di lavaggio, rendendo l'identificazione delle interazioni minore affinità impegnativi. Quarto, condizioni ambientali, quali pH, concentrazione di ioni, o la presenza di altre molecole endogene possono variare spazialmente all'interno della cellula e sono talvolta prerequisiti per interazioni farmaco-bersaglio. Così, trovare le condizioni corrette per consentire e mantenere al di fuori della cellula legame può richiedere una quantità significativa di tentativi ed errori.
etichettatura Photoaffinity elude questi problemi, consentendo il legame di una piccola molecola e il suo obiettivo nel contesto nativo di una cellula covalente. Invece di immobilizzare la piccola molecola ad una grande resina ingombrante, la molecola viene invece modificato chimicamente installare due piccoli g funzionaliruppi: un residuo fotoattivabile che permette covalente reticolazione alla proteina bersaglio quando irradiato con una particolare lunghezza d'onda della luce, e un gruppo giornalista che permette la proteina bersaglio da rilevare e successivamente isolato. cellule vive sono trattati con la sonda photoaffinity, la sonda si lega covalentemente e reticola alla proteina bersaglio, e il complesso sonda proteina è poi isolato intatto. La specificità di legame al bersaglio sonda è dimostrata effettuando un esperimento di competizione in parallelo, dove un eccesso del composto originario è utilizzato per competere via legame della sonda alla proteina bersaglio.
La progettazione e la sintesi di sonde photoaffinity varia notevolmente da una piccola molecola ad un altro, e non saranno coperti in questo protocollo; tuttavia, diversi ottimi discussioni sul tema sono stati pubblicati 5-9. La considerazione principale è che la sonda mantiene la bioattività del composto originario, quindi presumabmente vincolante per la stessa destinazione (s). Relazione struttura-attività (SAR) studi devono essere effettuati per determinare quali parti della molecola possono essere modificate senza perdita di bioattività. Una varietà di diversi gruppi chimici sono stati utilizzati come reticolanti fotoattivabile, tra diazirine, benzofenone, e aril azide, che hanno ciascuno vantaggi e svantaggi 10. Inoltre, ci sono più tag giornalista che sono stati utilizzati per isolare proteine sonda vincolante. Gruppi Reporter possono essere funzionale da soli, come la biotina comunemente usato o tag fluorescenti, o possono essere precursori che richiedono ulteriori funzionalizzazione successivamente alla fase photocrosslinking, che hanno il vantaggio di essere più piccolo e quindi meno probabilità di compromettere bioattività 11.
In questo protocollo, abbiamo utilizzato una sonda photoaffinity contenente un gruppo diazirine photocrosslinking, e un alchino terminale per il fissaggio di un gruppo giornalista attraverso un Cu (I) -catalyzEd azide-Acetilene Sharpless-Huisgen cicloaddizione (o click) reazione di 12-15. Gli studi SAR, sonda progettazione e sintesi, e risultati di questi studi sono stati pubblicati altrove 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi approcci per identificare gli obiettivi di piccole molecole possono essere sostanzialmente raggruppati in due categorie: top-down, in cui il fenotipo cellulare del farmaco è usato per limitare i suoi potenziali obiettivi in base alle loro funzioni note, o bottom-up, in cui l'obiettivo è identificato direttamente con mezzi chimici o genetici 3. Top-down o studi fenotipici in grado di identificare alcuni processi cellulari colpite dal farmaco (per esempio, la trascrizione / traduzio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
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