Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
pequeñas moléculas bioactivas, fundamentalmente, funcionan mediante la interacción con y alterar la función de una o más moléculas "objetivo", más comúnmente proteínas, en la célula. En el descubrimiento de fármacos, cuando un compuesto activo se descubrió mediante el cribado fenotípico, la identificación de la diana molecular (s) de ese compuesto es crucial, no sólo para entender el mecanismo de acción y efectos secundarios potenciales del compuesto, sino también para potencialmente descubrir nueva biología que subyace al modelo de enfermedad y allanando el camino para el desarrollo de nuevas clases mecanicistas de la terapéutica 1. A pesar de la identificación de objetivos no se requiere de un medicamento para ser utilizado terapéuticamente, en los últimos años ha habido un creciente reconocimiento de que los nuevos candidatos a fármacos tienen más probabilidades de tener éxito en ensayos clínicos, y por lo tanto obtener mejores rendimientos de la inversión, si una diana validada es conocida 2. Por lo tanto, ha habido un creciente interés en métodos para la identificación de pequeñaproteínas diana molécula.
Un experimento de identificación de objetivos clásica normalmente se basa en la purificación por afinidad, en donde la pequeña molécula de interés es inmovilizado en una resina y se incubó con lisados de células enteras, después de lo cual las proteínas no unidos son lavados y las proteínas restantes se eluyeron y se identificaron 3. Aunque esta técnica se ha utilizado para identificar los objetivos de muchas moléculas pequeñas 4, no es adecuado como método de ID de destino universal para varias razones. En primer lugar, la proteína diana debe retener su conformación nativa en la lisis celular con el fin de conservar su capacidad de unirse a la molécula pequeña. Esto puede ser particularmente problemático para las proteínas de membrana, que a menudo se someten a cambios conformacionales después de haber sido retirado de su ambiente nativo, o simplemente agregan y precipitan de la solución. En segundo lugar, la molécula pequeña tiene que ser modificado químicamente de una manera tal que puede ser inmovilizado en la resina mientras se mantienesu capacidad de unirse la proteína diana. por lo tanto, bolsillos de unión profundos pueden llegar a ser inaccesibles a una molécula pequeña, una vez que está fijado a la resina. En tercer lugar, la afinidad de unión debe ser suficientemente alta de que la interacción se mantiene durante las etapas de lavado, haciendo la identificación de interacciones de afinidad inferiores desafiantes. En cuarto lugar, las condiciones ambientales tales como el pH, concentración de iones, o la presencia de otras moléculas endógenas pueden variar espacialmente dentro de la célula y, a veces son requisitos previos para las interacciones fármaco-diana. Por lo tanto, la búsqueda de las condiciones adecuadas para permitir y mantener fuera de la célula de unión puede requerir una cantidad significativa de ensayo y error.
marcaje de fotoafinidad evita estos problemas al permitir la unión de una molécula pequeña y su diana en el contexto nativo de una célula covalente. En lugar de inmovilización de la molécula pequeña en gran resina voluminosa, la molécula se modifica químicamente en lugar de instalar dos pequeños g funcionalrupos: un resto fotoactivable que permite la reticulación covalente a la proteína diana cuando se irradia con una longitud de onda particular de la luz, y un grupo indicador que permite que la proteína diana a detectar y se aisló posteriormente. Las células vivas se tratan con la sonda de fotoafinidad, la sonda se une de forma covalente y reticula a la proteína diana, y el complejo sonda-proteína es entonces aislado intacto. La especificidad de unión a la diana de la sonda se demuestra mediante la realización de un experimento de competición en paralelo, donde se utiliza un exceso del compuesto original para competir de distancia de unión de la sonda a la proteína diana.
El diseño y síntesis de sondas de fotoafinidad varía mucho de una pequeña molécula a otra, y no serán cubiertos en este protocolo; Sin embargo, varios excelentes discusiones sobre el tema han sido publicadas 5-9. La consideración principal es que la sonda mantiene la bioactividad del compuesto de origen, por lo tanto presumably la unión a la misma diana (s). relación estructura-actividad (SAR) Los estudios deben llevarse a cabo para determinar qué partes de la molécula pueden ser modificadas sin pérdida de bioactividad. Una variedad de diferentes grupos químicos se han utilizado como agentes de entrecruzamiento fotoactivables, incluyendo diazirina, benzofenona, y azida de arilo, que tienen cada uno ventajas y desventajas 10. Asimismo, hay varias etiquetas reportero que se han utilizado para aislar proteínas de unión a la sonda. Grupos informadores pueden ser funcionales por su cuenta, tales como la biotina se utiliza comúnmente o etiquetas fluorescentes, o pueden ser precursores que requieren más de funcionalización posterior a la etapa fotorreticulación, que tienen la ventaja de ser más pequeño y por lo tanto menos susceptible de comprometer la bioactividad 11.
En este protocolo, se ha utilizado una sonda de fotoafinidad que contienen un grupo diazirina fotorreticulación, y un alquino terminal para la unión de un grupo informador a través de un Cu (I) -catalyzcicloadición ed azida-alquino Sharpless-Huisgen (o clic) reacción de 12-15. Los estudios de SAR, la sonda de diseño y síntesis, y los resultados de estos estudios han sido publicados en otra parte 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferentes enfoques para la identificación de los objetivos de moléculas pequeñas se pueden agrupar en dos categorías: de arriba hacia abajo, cuando se utilice el fenotipo celular del fármaco para reducir sus posibles objetivos sobre la base de sus funciones conocidas, o de abajo hacia arriba, donde el objetivo se identifica directamente por medios químicos o genéticos 3. De arriba hacia abajo o estudios fenotípicos pueden identificar ciertos procesos celulares afectados por el fármaco (por ejemp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
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