Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status
Summary
Wir beschreiben ein Hochdurchsatz-Multiplex, und gezielte proteomic Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) -Assay mit Potential für klinische Umsetzung entwickelt. Der Test kann für Neurodegeneration, wie Apolipoprotein E-Varianten (E2, E3 und E4), und messen deren allelische Expression potentielle Marker und Risikofaktoren zu quantifizieren.
Abstract
Viele neurodegenerative Erkrankungen fehlen noch wirksame Behandlungen. Zuverlässige Biomarker für die Identifizierung und Klassifizierung dieser Krankheiten wird in der Entwicklung zukünftiger neuer Therapien wichtig sein. Oft potentielle neue Biomarker machen es nicht in die Klinik wegen der Beschränkungen in ihrer Entwicklung und hohen Kosten verbunden. Allerdings gezielte Proteomik Multiple Reaction Monitoring-Flüssigchromatographie-Tandem / Massenspektrometrie (MRM LC-MS / MS) unter Verwendung, insbesondere Triple-Quadrupol-Massenspektrometer verwendet wird, ist ein Verfahren, das verwendet werden kann, um schnell auszuwerten und zu bestätigen Biomarker für die klinische Umsetzung in diagnostische Laboratorien . Traditionell wurde diese Plattform extensiv für die Messung von kleinen Molekülen in klinischen Laboratorien verwendet worden, aber es ist das Potential Proteine zu analysieren, dass es eine attraktive Alternative zu ELISA (enzyme-linked Immunosor machtgebogen Assay) -basierte Methoden. Wir beschreiben hier, wie gezielte Proteomik eingesetzt werden können Multiplex-Marker der Demenz zu messen, einschließlich der Nachweis und die Quantifizierung des bekannten Risikofaktor Apolipoprotein E-Isoform 4 (ApoE4).
Um den Test geeignet für die Übersetzung zu machen, ist es entworfen, schnelle, einfach zu sein, hochspezifische und kosteneffektiv. Um dies zu erreichen, muss jeder Schritt in der Entwicklung des Assays für die einzelnen Proteine und Gewebe optimiert werden sie analysiert werden. Diese Methode beschreibt ein typischer Arbeitsablauf, einschließlich verschiedener Tips und Tricks zu entwickeln für die Translation eine gezielte Proteomik MRM LC-MS / MS .
Die Methodenentwicklung wird unter Verwendung von optimierten benutzerdefinierten synthetisierten Versionen von tryptischen quantotypic Peptide, die die MS zur Detektion kalibrieren und dann versetzt in CSF korrekte Identifizierung des endogenen Peptid in der chromatographischen Trennung vor der Analyse in den MS zu bestimmen. Um das zu erreichen absolute Quantifizierung, stabilen Isotopen-markierten internen Standard-Versionen der Peptide mit kurzen Aminosäuresequenz-Tags und eine Trypsinspaltstelle enthalten, werden in dem Test enthalten.
Introduction
Die zunehmende Bedeutung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit, Lewy – Körperchen – Demenz und Parkinson-Krankheit, wird zu einer sozio – ökonomischen Problem in vielen Ländern 1. Es besteht ein Bedarf an zusätzlichen Biomarkern, die verwendet werden können, um Patienten in den frühen Stadien der Krankheit zu identifizieren und zu klassifizieren, und mögliche neue Behandlungen zu überwachen. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine generische Pipeline für eine schlanke, wirtschaftliche und schnelleren Weg der Validierung Potential CSF-Marker der Neurodegeneration zu erstellen. Der Grund dafür ist, gezielte Proteomik oder Peptid MRM LC-MS / MS als leicht abänderbar Methode zu verwenden, um mehrere potentielle Protein-Biomarkern von der Entdeckung Experimente beurteilen. Diese können weiter über einen schnellen chromatographischen Trennung gemultiplext werden (<10 min) und bewertet. In diesem Multiplex-Bildschirm für neurodegenerative Biomarkern haben wir die bekannten Demenz Risikofaktor Apolipoprotein E4-Isoform (ApoE4) enthalten, so ca wirn bestimmen gleichzeitig ihren Status und Umfang der Expression, durch das 2 die Notwendigkeit für separate Genotypisierungstests beseitigen. LC MS / MS wird routinemäßig als Methode der Wahl verwendet zur genauen Quantifizierung kleine Moleküle gegenüber anderen Methoden, wie ELISA oder Radioimmuntest (RIA). Diese Verschiebung in der Verwendung von MS-Technologie zur Analyse Proteine wurde hauptsächlich durch Probleme mit der immuno-basierten Technologien angetrieben. Dazu gehören Kreuzspezifität, Chargenstreuung, begrenzte Haltbarkeit und hohe Kosten. Daher wird gezielt Proteomik schnell eine wachsende Alternative zu Antikörpern basierende Verfahren wie Western-Blot, RIA und ELISA werden. Um jedoch die Fähigkeit , viele Markierungen in einem Assay multiplexen ist der große Vorteil dieser Technik gegenüber immuno-basierten Verfahren 3. Die Technik ist anwendbar auf viele Gewebe und wurde als eine Validierungsstrategie für viele Proteomstudien einschließlich Plasma und Urin – 4 5,6 verwendet.
Die technique kann zu jedem Labor angewendet werden, die sich mit der Triple-Quadrupol-Massenspektrometer Zugang und Know-how verfügt. Peptid-Design ist relativ einfach mit dem wachsenden Einsatz von Open-Source-Datenbanken. Der Wettbewerb geprägten Markt der kundenspezifischen Peptiden Synthese macht sie viel günstiger. Schwere Peptide, sind jedoch teuer und daher sind die Marker sollten in einem größeren Maßstab, bevor er auf einen kleinen Kohorte beurteilt werden. Es gibt immer mehr Potenzial für die Technik, die in den klinischen Diagnoseeinstellungen verwendet werden, wobei die meisten großen Krankenhäuser Triple-Quadrupol-basierten Plattformen, die die leicht angepasst werden kann, um gezielt Proteom-Assays laufen. Eine solche Anwendung des Verfahrens wird es in die Routinediagnostik Einstellung vornehmen, ist die jüngste Anwendung Neugeborenen Blutfleck – Screening für Sichelzellenanämie 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie bei allen MS basierenden Assays sind die kritischen Schritte in dem Verfahren der Bestimmung der geeigneten und genauen Mengen von internen Standards. Wenn absolute Quantifizierung verwendet wird, dann sind die richtigen Mengen an Stachel Peptide in der Standardkurve sind ebenfalls entscheidend.
Unser Test erfordert nicht die Fällung des CSF oder die Verwendung von jeder Art von Sanierung oder Entsalzen Schritte vor der MS-Analyse – es ist eine völlig Eintopfreaktion Verfahren. Aufgrun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
| Urea | Sigma | U0631-500g |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
| heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
| Thiourea | Sigma | T7875-500G |
| Tris base | Sigma | T6066 |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
| Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
| 300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
| Acquity UPLC system | Waters |
References
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