Мы описываем высокой пропускной способностью, мультиплекс, и целевой Протеомные спинномозговой жидкости (CSF) анализ, разработанный с потенциалом для клинического перевода. Тест может количественно оценить потенциальные маркеры и факторы риска для нейродегенеративных, такие как варианты гена аполипопротеина Е (Е2, Е3 и Е4), и измерить их аллельного выражение.
Многие нейродегенеративные заболевания , до сих пор отсутствуют эффективные методы лечения. Надежные биомаркеры для идентификации и классификации этих заболеваний будет иметь важное значение в развитии будущих новых видов лечения. Часто потенциальные новые биомаркеры не делают его в клинику из-за ограничений в их развитии и высокими затратами. Тем не менее, целевые протеомики с использованием множественного контролировании реакции жидкостной хроматографии-тандем / масс-спектрометрии (МРМ ЖХ-МС / МС), в частности, с помощью тройных квадрупольные масс-спектрометры, является одним из методов, который может быть использован для быстрой оценки и подтверждения биомаркеров для клинического перевода в диагностические лаборатории , Традиционно, эта платформа широко используется для измерения малых молекул в клинических лабораториях, но потенциал для анализа белков, что делает его привлекательной альтернативой ELISA (Enzyme-Linked Immunosorсогнуты анализа) основе методов. Здесь мы опишем, как целенаправленный протеомики могут быть использованы для измерения уплотненных маркеров деменции, в том числе детекции и количественного определения известного фактора риска алипопротеина изоформы 4 (apoE4).
Для того чтобы сделать анализ подходит для перевода, он предназначен, чтобы быть быстрым, простым, высокоспецифичным и экономически эффективным. Для достижения этой цели, каждый шаг в развитии анализа должны быть оптимизированы для отдельных белков и тканей они анализируются. Этот метод описывает типичный рабочий процесс, включая различные советы и приемы для разработки целевых протеомика MRM LC-MS / MS для перевода ,
Разработка метода оптимизирована с использованием пользовательских синтезированные версии триптических quantotypic пептидов, которые откалибровать MS для обнаружения, а затем подскочили в CSF, чтобы определить правильную идентификацию эндогенного пептида в хроматографического разделения до анализа в MS. Для достижения ABSOLUТ.Е. Количественную, стабильные меченого изотопом внутренний стандарт версии пептидов с бирками порядковых кислоты коротким амино- и содержащий сайт расщепления трипсином, включены в анализ.
Растущее влияние нейродегенеративных заболеваний , таких как болезнь Альцгеймера, деменция с тельцами Леви и болезнь Паркинсона, становится социально – экономической проблемой во многих странах 1. Существует потребность в дополнительных биомаркеров, которые могут быть использованы для идентификации и классификации пациентов на ранних стадиях заболевания, а также для мониторинга любых потенциальных новых методов лечения. Общая цель этого метода заключается в создании общего трубопровода для обтекаемой, экономичным и быстрым способом проверки потенциальных маркеров CSF нейродегенерации. Смысл заключается в использовании целевых протеомики или пептида MRM LC-MS / MS, как легко исправимо метод для оценки множества потенциальных биомаркеров белка из экспериментов обнаружения. Они могут быть далее мультиплексированы более быстрым хроматографическим разделением (<10 мин) и оценены. В пределах этого мультиплекса экрана для нейродегенеративных биомаркеров, мы включили известный фактор риска развития слабоумия аполипопротеина E4 изоформы (apoE4), поэтому мы чап одновременно определить его статус и уровень экспрессии, тем самым устраняя необходимость в отдельных тестах генотипирования 2. LC-MS / MS обычно используется в качестве метода выбора для точного количественного анализа малых молекул, по сравнению с другими методами, такими как ELISA или иммунологического анализа (RIA). Этот сдвиг в использовании технологии MS для анализа белков, было обусловлено в основном проблемами с иммуно-технологии. Они включают в себя кросс-специфичность, от партии к партии изменения, ограниченный срок годности, а также высокую стоимость. Поэтому целенаправленные протеомика быстро становится растущей альтернативой методам антител на основе таких как Вестерн-блоттинга, RIA и ELISA. Тем не менее, способность мультиплексировать множество маркеров в одном анализе является основным преимуществом этого метода над иммуно на основе методов 3. Методика применима ко многим тканям и использовалась в качестве стратегии аттестации для многих протеомики исследований , включая плазму 4 и мочи 5,6.
тэchnique может быть применен к любой лаборатории, которая имеет доступ и опыт в использовании тройные квадрупольные масс-спектрометры. Конструкция Пептид является относительно простым с растущим использованием баз данных с открытым исходным кодом. Конкурентный рынок синтеза пептидов пользовательских делает их гораздо более доступными. Тяжелые пептиды, однако, являются дорогостоящими и поэтому маркеры должны быть оценены на небольшой когорте до переезда в более крупном масштабе. Существует растущий потенциал для техники для использования в клинических диагностических параметрах, при этом большинство крупных больниц, имеющих тройные платформы на базе квадрупольные, которые могут быть легко адаптированы для выполнения целевых протеомические анализов. Одним из таких применений метода, что делает его в рутинной диагностической установке, является его недавнее применение к скрининга новорожденных пятна крови на серповидно – клеточная анемия 7.
Как и со всеми на основе MS анализов, критические шаги в методе являются определение соответствующих и точных сумм внутренних стандартов. Если абсолютное Количественное определение используется, то правильные количества меченых пептидов в стандартной кривой также имеют важное значен…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
Urea | Sigma | U0631-500g |
Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
Thiourea | Sigma | T7875-500G |
Tris base | Sigma | T6066 |
VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
Acquity UPLC system | Waters |