Antibody Labeling med fluorescerande färger med hjälp av magnetisk protein A och protein G pärlor
Summary
Den on-bead förfarande för märkning av antikroppar med små molekyler möjliggör märkning av en liten mängd av antikroppar direkt från cellmedia. Denna metod är kompatibel med amin och tiol kemi och kan hantera flera prover parallellt, manuellt eller med hjälp av automatiserade plattformar.
Abstract
Antikroppar märkta med små molekyler som fluorescerande färgämnen, cytostatika och radioaktiva spårämnen är viktiga verktyg inom biomedicinsk forskning, immunodiagnostik och på senare tid som terapeutiska medel. Traditionella metoder för märkning av antikroppar med små molekyler kräver renade antikroppar vid relativt hög koncentration, involvera flera dialyssteg och har begränsad genomströmning. Men flera tillämpningar, inklusive området för antikropp läkemedelskonjugat (ADC), kommer att gynnas av nya metoder som gör att märkning av antikroppar direkt från cellmedia. Sådana metoder kan tillåta antikroppar att screenas i biologiskt relevanta analyser, till exempel, den receptormedierade antikropp interna assay i fallet med ADCs. Här beskriver vi en (metod on-bead) metod som möjliggör märkning av små mängder av antikroppar direkt från cellmedia. Detta tillvägagångssätt använder hög kapacitet magnetisk Protein A och Protein G affinitetspärlor att fånga antikropparfrån cellmedia följt av märkning med små molekyler med användning av antingen aminen eller tiol kemi och efterföljande eluering av de märkta antikropparna. Ta fluorescerande färgämnen som surrogat för små molekyler, visar vi on-bead märkning av tre olika musantikroppar direkt från cellmedia med användning av både amin och tiol märkning kemi. Den höga bindningsaffiniteten av antikroppar till protein A och protein G säkerställer höga utbyten samt hög renhet av de märkta antikropparna. Dessutom, användning av magnetiska pärlor kan flera prover som skall hanteras manuellt, vilket avsevärt förbättrar märkning genomströmning.
Introduction
Antikroppar märkta med små molekyler är kanske de vanligaste reagens i biologi 1,2. Antikroppar märkta med fluorescerande färgämnen och biotin används flitigt i bildbehandling, immun, flödescytometri, western blöts, och immunoprecipitation bland andra program 3-6. Radioaktivt märkta antikroppar 3,7 finna omfattande användning i diagnostik och behandling, antikroppar märkta med cytostatika (ADC) erbjuder nya alternativ för behandling av cancer, och två ADC har redan godkänts för terapeutisk användning 8. Trots sin omfattande användning, har metoder för att märka antikroppar förblev förvånansvärt oförändrad och innefattar typiskt flera reaktioner och avsaltning steg 9-12. Lösningsmetoder fungerar mycket bra i de fall där endast ett fåtal antikroppar måste märkas och finns i högrenad form vid hög koncentration och i tillräckliga volymer. Men för nyare applikationer som ADC, det finns enbehöver för att märka antikroppar vid den tidiga hybridom stadium så att de kan screenas med avseende biologiskt relevanta egenskaper, till exempel, receptorförmedlad antikropp interna 13-16. Vid hybridomet skede provvolymer är begränsade, antikroppar uttrycks vid låga koncentrationer och ett antal prover är stora, därav lösning baserad märkningsmetoder är inte lämpliga.
För att förenkla och förbättra genomströmningen av de traditionella antikroppsmärkning metoder har några alternativa metoder föreslagits 17,18. Ett tillvägagångssätt är att använda icke-magnetiska protein A affinitetspärlor packade i små kolonner för att fånga antikroppar följt av märkningsreaktionen och eluering av märkt och renat protein. Denna metod kan användas för att märka antikroppar direkt från cellmedia, emellertid, kan användningen av kolumnerna mödosam. En magnetisk pärla baserad metod har nyligen rapporterats 19 som eliminerar användningen av kolonner och förbättrar genomströmning men på grundav den begränsade antikroppsbindande kapacitet av pärlorna, kunde bara nanogram till låga mikrogramkvantiteter av antikropparna märkas.
Vi har nyligen utvecklat och använt hög kapacitet magnetisk Protein A och Protein G pärlor (> 20 mg av humant IgG / ml av avvecklade pärlor) för att märka antikroppar närvarande i cell media med små molekyler 20. Den höga kapaciteten av pärlorna gör att tiotals till hundratals mikrogram av antikropp som skall märkas enkelt och den snabba magnetiska respons av pärlorna förenklar hantering och bearbetning av ett stort antal prover parallellt. Användning av fluorescerande färgämnen som surrogat för små molekyler, visar vi att metoden är kompatibel med amin och tiol märkning kemi och erbjuder höga utbyten av märkta och mycket rena antikroppar.
Detta protokoll och tillhörande video beskriver på pärla märkning av mus-antikroppar närvarande i cellen media med Magnetic Protein A och protein G pärlor. Protokollet äruppdelad i fyra sektioner: Avsnitt 1 beskriver infångandet av antikroppar på pärlan från biologiska prover. Efter infångning är märkning av antikroppar med fluorescerande färg med hjälp av amin kemi eller använda tiol kemin beskriven i avsnitt 2 och 3 § respektive. Slutligen, avsnitt 4 beskriver metoden för beräkning av antikroppskoncentrationen och färgämnet till antikropp förhållande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denna studie var att utveckla en metod för att märka antikroppar, som föreligger i cellmediet vid låga koncentrationer, med en mängd olika små molekyler. En sådan metod kommer att möjliggöra ett stort antal antikroppar, under de tidiga stadierna av antikropp upptäckt, som ska märkas med små molekyler och screenades med användning av en biologiskt relevant analys. En sådan analys är receptorförmedlad antikropp interna analys där internalisering kan variera mellan antikroppar även med liknande…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
- Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
- Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
- Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
- Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
- Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
- Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , 380-382 (1996).
- Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
- Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
- Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
- Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
- Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
- Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
- Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
- Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
- Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
- Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
- Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
- Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
- Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
- Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).
