磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング
Summary
小分子を有する抗体を標識するためにビーズ法は、細胞培地から直接抗体の少量の標識化を可能にします。この方法は、アミンおよびチオール化学と互換性があり、手動または自動化されたプラットフォームを使用して、並行して複数のサンプルを処理することができます。
Abstract
蛍光染料のような小分子、細胞毒性薬、および放射性トレーサーで標識した抗体は、本質的な生物医学研究のツール、免疫診断およびより最近の治療薬としてあります。小分子を用いて抗体を標識するための従来の方法は、比較的高い濃度で精製された抗体を必要とする複数の透析工程を含み、スループットが制限されています。しかし、抗体薬剤コンジュゲート（ADC）ですの分野を含むいくつかのアプリケーションでは、細胞培地から直接抗体の標識化を可能にする新しい方法の恩恵を受ける。このような方法は、例えば、抗体は、生物学的に関連するアッセイにおいてスクリーニングされるADCの場合の受容体媒介性抗体内在化アッセイを可能にすることができます。ここでは、直接細胞培地から抗体の少量の標識化を可能にする方法（オン・ビーズ法）を説明します。このアプローチは、抗体を捕捉するために、高容量の磁気プロテインA及びプロテインG親和性ビーズを利用しますアミン又はチオール化学および標識抗体のその後の溶出のいずれかを使用して小分子で標識することにより、続いて細胞培地から。小分子の代替物として蛍光色素を取って、我々は、アミンおよびチオール標識化学の両方を用いて細胞培地から直接三つの異なるマウス抗体のビーズの標識を示します。プロテインA及びプロテインGに対する抗体の高い結合親和性は高い回収率だけでなく、標識抗体の高純度を保証します。また、磁性ビーズの使用が著しく標識スループットを向上させる、複数のサンプルを手動で処理することを可能にします。
Introduction
小分子で標識された抗体は、おそらく生物学1,2で最も一般的に使用される試薬です。蛍光色素とビオチンで標識された抗体広範囲撮像に使用される、免疫アッセイ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびその他のアプリケーション3-6間の免疫沈降。放射性標識した抗体3,7イメージングおよび治療 における広範な使用を見出す、細胞毒性薬（のADC）で標識した抗体は、癌の治療に新たな選択肢を提供している、と2個のADCは、既に治療的使用の8のために承認されています。その広範な使用にもかかわらず、抗体を標識するための方法は、驚くほど変化しないままで、通常は複数の反応を伴い、脱塩が9-12ステップしています。解決方法は、わずか数抗体が標識される必要があり、高濃度で高度に精製された形態で利用可能である場合には、十分なボリュームで非常にうまく機能します。しかし、ADCのような新しいアプリケーションのために、そこにあります例えば、それらは生物学的に関連する特性についてスクリーニングすることができるように、初期のハイブリドーマ段階で抗体を標識する必要があり、受容体媒介性抗体の内在13-16。ハイブリドーマ段階で、サンプル容量は限られている抗体が低濃度で発現され、サンプルの数は、従って、溶液ベースの標識方法は適していない、大きいです。
従来の抗体標識法のスループットを簡素化し、改善するために、いくつかの代替的なアプローチは、17,18提案されています。一つのアプローチは、標識および精製されたタンパク質の標識反応と溶出した抗体を捕捉するために、非磁性タンパク質小さなカラムに充填親和性ビーズを使用することです。この方法は、細胞培地から直接抗体を標識するために使用することができるが、列の使用が面倒であることができます。磁気ビーズに基づく方法は、最近のカラムの使用を排除し、スループットが、原因を改善すること19が報告されていますビーズの結合能力を制限された抗体には、抗体の低マイクログラム量にのみナノグラムを標識することができました。
我々は最近開発され、小分子20と細胞培地中に存在する抗体を標識するために、高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズ（落ち着いたビーズのヒトIgG / mlでの> 20 mg）を使用しました。ビーズの高容量は、抗体のマイクログラム数十〜数百が便利に標識することを可能にし、ビーズの迅速な磁気応答は、並列に多数のサンプルの取り扱いおよび処理を簡素化します。小分子の代替物として蛍光色素を使用して、我々は、この方法は、アミンおよびチオール標識化学と互換性があり、標識され、非常に純粋な抗体の高い回収率を提供していますことを示しています。
このプロトコルおよび付随するビデオは、磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いて細胞培地中に存在するマウス抗体のビーズ上の標識を説明します。プロトコルです4つのセクションに分かれて：第1節では、生物学的サンプルからビーズへの抗体の取り込みについて説明します。捕捉に続いて、アミン化学を用いて、またはチオール化学を用いて蛍光色素を有する抗体の標識は、それぞれ、セクション2およびセクション3に記載されています。最後に、セクション4は、抗体濃度の計算および抗体比染料のための方法が記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究の目的は、小分子の様々な、低濃度で細胞培地中に存在する抗体を標識する方法を開発することでした。抗体発見の初期段階で多数の抗体を可能にするような方法では、小分子で標識され、生物学的に関連するアッセイを用いてスクリーニングすることができます。 1つのこのようなアッセイは内在化があっても同様の結合親和性を有する抗体の間で変動し得る受容体が媒介する抗?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
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