Antibody Labeling con tintes fluorescentes utilizando proteína magnética A y Proteína G cuentas
Summary
El método en el talón para el marcaje de anticuerpos con moléculas pequeñas permite el etiquetado de una pequeña cantidad de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este método es compatible con la amina y la química de tiol, y puede manejar múltiples muestras en paralelo, de forma manual o utilizando plataformas automatizadas.
Abstract
Anticuerpos marcados con pequeñas moléculas como colorantes fluorescentes, fármacos citotóxicos, y trazadores radiactivos son herramientas esenciales en la investigación biomédica, inmunodiagnóstico y más recientemente como agentes terapéuticos. Los métodos tradicionales para marcar anticuerpos con moléculas pequeñas requieren anticuerpos purificados a una concentración relativamente alta, implican múltiples etapas de diálisis y han limitado el rendimiento. Sin embargo, varias aplicaciones, incluyendo el campo de Drogas de anticuerpos conjugados (ADC), se beneficiarán de nuevos métodos que permitan el etiquetado de anticuerpos directamente desde el soporte de células. Tales métodos pueden permitir que los anticuerpos que se proyectarán en ensayos biológicamente relevantes, por ejemplo, el ensayo de internalización de anticuerpos mediada por el receptor en el caso de ADCs. A continuación, describimos un (método on-perla) método que permite el etiquetado de pequeñas cantidades de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este enfoque utiliza la alta capacidad de la proteína magnética A y la proteína G perlas de afinidad para capturar anticuerposde los medios de células seguido de marcaje con moléculas pequeñas usando ya sea química de amina o tiol y la posterior elución de los anticuerpos marcados. Tomando tintes fluorescentes como sustitutos de moléculas pequeñas, se demuestra el etiquetado en el cordón de tres diferentes anticuerpos de ratón directamente desde el soporte de células utilizando tanto la química amina y tiol etiquetado. La alta afinidad de unión de anticuerpos a la proteína A y la proteína G asegura recuperaciones altas así como una alta pureza de los anticuerpos marcados. Además, el uso de perlas magnéticas permite múltiples muestras para ser manejados manualmente, con lo que mejora significativamente el rendimiento de etiquetado.
Introduction
Anticuerpos marcados con moléculas pequeñas son, quizás, los reactivos usados más comúnmente en biología 1,2. Los anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes y biotina se utilizan ampliamente en formación de imágenes, inmunoensayos, citometría de flujo, transferencias de Western, inmunoprecipitación y entre otras aplicaciones 3-6. Los anticuerpos radiomarcados 3,7 encuentran un amplio uso en formación de imágenes y terapia, anticuerpos marcados con fármacos citotóxicos (ADCs) están ofreciendo nuevas opciones para el tratamiento de cánceres, y dos ADC ya han sido aprobados para su uso terapéutico 8. A pesar de su amplio uso, los métodos para marcar anticuerpos se han mantenido sorprendentemente sin cambios y por lo general involucran a múltiples reacciones y desalado pasos 9-12. métodos de solución funcionan muy bien en los casos en que sólo unos pocos anticuerpos deben ser etiquetados y están disponibles en forma altamente purificada en una concentración elevada y en volúmenes suficientes. Sin embargo, para nuevas aplicaciones como ADCs, hay unatenga que marcar anticuerpos en la fase temprana de hibridoma para que puedan ser evaluados para propiedades biológicamente relevantes, por ejemplo, la internalización de anticuerpos mediada por receptores 13-16. En la etapa de hibridoma, los volúmenes de muestra son limitados, los anticuerpos se expresan en concentraciones bajas y un número de muestras son grandes, por lo tanto, métodos de etiquetado a base de soluciones no son adecuados.
Para simplificar y mejorar el rendimiento de los métodos tradicionales de etiquetado de anticuerpos, algunos enfoques alternativos se han propuesto 17,18. Un enfoque consiste en utilizar las proteínas no magnético A perlas de afinidad envasados en pequeñas columnas para capturar anticuerpos seguido de la reacción de marcaje y la elución de la proteína marcada y purificada. Este método se puede utilizar para marcar anticuerpos directamente desde el soporte de células, sin embargo, el uso de columnas puede ser laborioso. Un método basado perla magnética Recientemente se ha informado 19 que elimina el uso de columnas y mejora el rendimiento pero debidoa la capacidad de las perlas de la unión del anticuerpo limitado, solamente nanogramo a cantidades de microgramos bajos de los anticuerpos podría ser etiquetado.
Recientemente hemos desarrollado y utilizado de alta capacidad magnética Proteína A y Proteína G cuentas (> 20 mg de IgG humana / ml de perlas sedentarios) para etiquetar los anticuerpos presentes en los medios de comunicación celular con moléculas pequeñas 20. La alta capacidad de las perlas permite decenas a cientos de microgramos de anticuerpo a ser etiquetados convenientemente y la respuesta magnética rápida de las perlas simplifica el manejo y procesamiento de un gran número de muestras en paralelo. El uso de colorantes fluorescentes como sustitutos de moléculas pequeñas, se muestra que el método es compatible con amina y tiol química etiquetado y ofrece altas recuperaciones de anticuerpos marcados y muy puros.
Este protocolo y el video que lo acompaña describen etiquetado en cordón de anticuerpos de ratón presentes en los medios de células utilizando cuentas de Proteína G magnética A y proteína. El protocolo esdividida en cuatro secciones: Sección 1 describe la captura de anticuerpos en la perla a partir de muestras biológicas. Después de la captura, el etiquetado de los anticuerpos con colorante fluorescente usando química de amina o tiol usando química se describe en las secciones 2 y la sección 3, respectivamente. Finalmente, la sección 4 se describe el método para el cálculo de la concentración de anticuerpos y el colorante a la proporción de anticuerpos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este estudio fue desarrollar un método para marcar anticuerpos, presentes en el medio celular a bajas concentraciones, con una variedad de moléculas pequeñas. Tal método permitirá a un gran número de anticuerpos, durante las primeras etapas de descubrimiento de anticuerpos, para ser etiquetados con moléculas pequeñas y se tamiza usando un ensayo biológicamente relevante. Uno de tales ensayos es el ensayo de internalización de anticuerpos mediada por el receptor, donde la internalización puede v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
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