फ्लोरोसेंट रंजक के साथ एंटीबॉडी लेबलिंग चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोतियों का उपयोग
Summary
छोटे अणुओं के साथ एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए ऑन-मनका विधि सेल मीडिया से सीधे एंटीबॉडी की एक छोटी राशि की लेबलिंग में सक्षम बनाता है। इस विधि अमाइन और thiol रसायन विज्ञान के साथ संगत है, और मैन्युअल रूप से या स्वचालित प्लेटफार्मों का उपयोग समानांतर में कई नमूने, संभाल कर सकते हैं।
Abstract
फ्लोरोसेंट रंजक, साइटोटोक्सिक दवाओं, और रेडियोधर्मी ट्रेसर जैसे छोटे अणुओं के साथ लेबल एंटीबॉडी चिकित्सीय एजेंट जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में आवश्यक उपकरण, immunodiagnostics और अधिक हाल ही के रूप में कर रहे हैं। छोटे अणुओं के साथ लेबलिंग एंटीबॉडी के लिए पारंपरिक तरीकों अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता में शुद्ध की आवश्यकता होती है एंटीबॉडी, कई डायलिसिस कदम शामिल और throughput सीमित है। हालांकि, एंटीबॉडी ड्रग conjugates (एडीसी) के क्षेत्र सहित कई अनुप्रयोगों, नए तरीकों कि एंटीबॉडी की लेबलिंग सेल मीडिया से सीधे अनुमति देगा से लाभ होगा। , एडीसी के मामले में रिसेप्टर की मध्यस्थता एंटीबॉडी internalization परख इस तरह के तरीकों एंटीबॉडी, जैविक रूप से प्रासंगिक assays में जांच की जा करने के लिए उदाहरण के लिए अनुमति दे सकता। यहाँ, हम एक विधि (ऑन-मनका विधि) कि सेल मीडिया से सीधे एंटीबॉडी की छोटी मात्रा की लेबलिंग के लिए सक्षम बनाता का वर्णन है। यह दृष्टिकोण एंटीबॉडी पर कब्जा करने के लिए उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी आत्मीयता के मोतियों का इस्तेमालया तो अमाइन या thiol रसायन शास्त्र और लेबल एंटीबॉडी के बाद क्षालन का उपयोग कर छोटे अणुओं के साथ लेबलिंग के द्वारा पीछा सेल मीडिया से। छोटे अणुओं के लिए सरोगेट मदर के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों ले रहा है, हम दोनों अमाइन और thiol लेबलिंग रसायन विज्ञान का उपयोग सेल मीडिया से सीधे तीन अलग-अलग माउस एंटीबॉडी के ऑन-मनका लेबलिंग प्रदर्शित करता है। एक प्रोटीन और प्रोटीन जी के लिए एंटीबॉडी के उच्च बंधन आत्मीयता उच्च वसूली के रूप में अच्छी तरह के रूप में लेबल एंटीबॉडी के उच्च शुद्धता सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, चुंबकीय मोती के उपयोग के कई नमूने जिससे काफी लेबलिंग throughput में सुधार मैन्युअल नियंत्रित किया जा करने के लिए, की अनुमति देता है।
Introduction
छोटे अणुओं के साथ लेबल एंटीबॉडी शायद जीव विज्ञान 1,2 में सबसे अधिक इस्तेमाल किया अभिकर्मकों हैं। फ्लोरोसेंट रंगों और बायोटिन के साथ लेबल एंटीबॉडी बड़े पैमाने पर इमेजिंग, immunoassays में इस्तेमाल कर रहे हैं, अन्य अनुप्रयोगों 3-6 के बीच प्रवाह cytometry, पश्चिमी blots, और immunoprecipitation। Radiolabeled एंटीबॉडी 3,7 के कैंसर के इलाज के लिए नए विकल्प की पेशकश कर रहे हैं, और दो एडीसी को पहले से ही चिकित्सकीय प्रयोग 8 के लिए अनुमोदित किया गया है इमेजिंग और चिकित्सा, साइटोटोक्सिक दवाओं (एडीसी) के साथ लेबल एंटीबॉडी में व्यापक उपयोग पाते हैं। उनके व्यापक उपयोग के बावजूद, लेबलिंग एंटीबॉडी के लिए तरीकों आश्चर्यजनक रूप से अपरिवर्तित बनी हुई है और आम तौर पर कई प्रतिक्रियाओं शामिल है और desalting कदम 9-12। समाधान के तरीकों मामलों में जहां केवल कुछ एंटीबॉडी लेबल किया जा करने की जरूरत है और उच्च एकाग्रता में अत्यधिक शुद्ध रूप में उपलब्ध हैं और पर्याप्त मात्रा में बहुत अच्छी तरह से काम करते हैं। एक हालांकि, एडीसी जैसे नए अनुप्रयोगों के लिए, वहाँ हैप्रारंभिक चरण में हाइब्रिडोमा एंटीबॉडी लेबल करने के लिए इतना है कि वे, जैविक रूप से प्रासंगिक गुण के लिए जांच की जा सकती है उदाहरण के लिए, रिसेप्टर की मध्यस्थता एंटीबॉडी internalization 13-16 के लिए की जरूरत है। हाइब्रिडोमा स्तर पर, नमूना मात्रा सीमित कर रहे हैं, एंटीबॉडी कम मात्रा में व्यक्त कर रहे हैं और नमूने के एक नंबर के बड़े हैं, इसलिए समाधान आधारित लेबलिंग तरीकों उपयुक्त नहीं हैं।
सरल और पारंपरिक तरीकों एंटीबॉडी लेबलिंग के throughput में सुधार करने के लिए, कुछ वैकल्पिक तरीकों 17,18 प्रस्तावित किया गया है। एक दृष्टिकोण गैर चुंबकीय एक प्रोटीन आत्मीयता के मोती छोटे स्तंभों में पैक का उपयोग करने के लिए लेबलिंग प्रतिक्रिया और लेबल और शुद्ध प्रोटीन की क्षालन द्वारा पीछा किया एंटीबॉडी कब्जा है। इस विधि सेल मीडिया से सीधे एंटीबॉडी लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, स्तंभों के उपयोग श्रमसाध्य हो सकता है। एक चुंबकीय मनका आधारित पद्धति हाल ही में 19 बताया गया है कि स्तंभों का उपयोग समाप्त और throughput लेकिन कारण में सुधारसीमित एंटीबॉडी बाध्यकारी मोतियों की क्षमता है, केवल एंटीबॉडी का कम माइक्रोग्राम मात्रा को nanogram लेबल किया जा सकता है।
हमने हाल ही में विकसित की है और उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोती (> मानव आईजीजी / बसे मोतियों की मिलीलीटर की 20 मिलीग्राम) छोटे अणुओं 20 के साथ सेल मीडिया में उपस्थित एंटीबॉडी लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया। मोतियों की उच्च क्षमता एंटीबॉडी की माइक्रोग्राम की सैकड़ों करने के लिए दसियों आसानी से लेबल किया जा अनुमति देता है और मोतियों की तेजी चुंबकीय प्रतिक्रिया हैंडलिंग और समानांतर में नमूने की एक बड़ी संख्या के प्रसंस्करण सरल करता है। छोटे अणुओं के लिए सरोगेट मदर के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर, हम बताते हैं कि विधि अमाइन और thiol लेबलिंग रसायन विज्ञान के साथ संगत है और लेबल और बहुत शुद्ध एंटीबॉडी के उच्च वसूलियां प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल और साथ वीडियो चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोतियों का उपयोग सेल मीडिया में मौजूद माउस एंटीबॉडी के ऑन-मनका लेबलिंग का वर्णन है। प्रोटोकॉल हैचार वर्गों में बांटा गया है: धारा 1 जैविक नमूने से मनका पर एंटीबॉडी का कब्जा वर्णन करता है। कब्जे के बाद, अमाइन रसायन विज्ञान का उपयोग कर या thiol रसायन विज्ञान का उपयोग फ्लोरोसेंट डाई के साथ एंटीबॉडी की लेबलिंग धारा 2 और 3 खंड में वर्णन किया गया है, क्रमशः। अंत में, धारा 4 एंटीबॉडी एकाग्रता की गणना और एंटीबॉडी के अनुपात करने के लिए डाई के लिए विधि का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन का लक्ष्य, एंटीबॉडी, कम मात्रा में सेल मीडिया में मौजूद लेबल करने के लिए छोटे अणुओं की एक किस्म के साथ एक विधि विकसित करने के लिए किया गया था। इस तरह की एक विधि एंटीबॉडी की एक बड़ी संख्या है, एंट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
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