Automatisert Robotic Leveringen Teknikk for Surface Veiledning og Bioprinting Celler

Summary

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Abstract

Dette manuskriptet beskriver innføring av cellen ledefunksjoner etterfulgt av direkte levering av celler til disse funksjonene i en hydrogel bioink hjelp av en automatisert robotdispenseringssystem. Den spesielle bioink ble valgt som det lar cellene til å sedimentere mot og forstand funksjonene. Doseringssystemet bioprints levedyktige celler i hydrogel bioinks bruker et mottrykk assistert skrivehodet. Men ved å erstatte skriverhodet med en skjerpet pennen eller skalpell, doseringssystemet kan også brukes til å lage topografiske signaler gjennom overflaten etsing. Pekepennen bevegelsen kan programmeres i trinn på 10 mikrometer i X, Y og Z. De mønstrede Sporene var i stand til å orientere stamceller, å påvirke dem til å innta en langstrakt morfologi i flukt med sporene 'retning. Mønstringen kan lages med plotting programvare i rette linjer, konsentriske sirkler, og sinusbølger. I en etterfølgende prosedyre, fibroEksplosjonene og mesenchymale stamceller ble suspendert i en 2% gelatin bioink, for bioprinting i et mottrykk drevet ekstrudering hodet. Cellen peiling bioink ble deretter trykket ved hjelp av de samme programmerte koordinater som brukes for etsing. De bioprinted cellene var i stand til å avføle og reagere på de etsede egenskaper som demonstrert ved deres langstrakte orientering langs retningen av etsede spor.

Introduction

Den bevisste fordelingen av celle plassering muliggjør dannelsen av kulturer som etterligner in vivo cellulære organisasjon ^en. Faktisk kan forskning på samspillet mellom flere celletyper bistås av å organisere deres romlige plassering ^2,3. De fleste mønster systemer er avhengige av overflaten modifisering prosedyrer for å fremme eller hindre celle adhesjon med påfølgende passiv celle deponering. Bioprinting tilbyr romlig og tidsmessig kontroll over celle distribusjoner ^1. I tillegg til disse funksjonene, er bioprinting blitt beskrevet som å være en teknisk enkel, rask og kostnadseffektiv metode for generering av geometrisk kompliserte stillaser ^4. Den utnytter datamaskinprogramvare og utforming tillater innføring av celler i fabrikasjonsprosessen ^4.

Bioprinting systemer har blitt kategorisert basert på deres arbeidsprinsipper som laser baserte, inkjet-baserte eller ekstrudering basert ⁴. Extrusion bioprinting har blitt beskrevet som den mest lovende som det lar fabrikasjon av organiserte konstruksjoner av klinisk relevante størrelser innenfor en realistisk tidsramme ^4-6. Den er utført av enten mekanisk eller mottrykk assistert ekstrudering av et cellelager hydrogel bioink. I fremgangsmåten presentert her, ble mottrykk anvendt. Som nevnt, blir cellene leveres i en cytocompatible bioink. En slik bioink bør støtte levering av celler uten å frembringe skadelige skjærspenning, og ha en tilstrekkelig viskositet til å beholde integriteten av den trykte spor, uten å bryte sammen eller spredning (referert til som "blekk bleed") ^7-10.

Interaksjonen av celler med sitt vedhengende overflate er kjent for å påvirke cellulær oppførsel. Overflaten topografi kan kontrollere cellen form, orientering ^11, og selv fenotype. Spesielt har fabrikasjon av spor og kanaler blitt vist å indusereen strukket, langstrakt morfologi på flere celletyper. Vedtakelsen av denne morfologi har blitt funnet å påvirke fenotypen av multipotente og pluripotente celler. For eksempel når justert på sporene, mesenchymale stamceller (MSC) viser tegn på differensiering mot cardiomyocytes ^12,13 og vaskulære glatte muskelceller vedta kontraktile fenotype over syntetisk ^10,14-17.

Cellen innretting kanaler eller spor kan genereres på en polymeroverflate via en rekke metoder, for eksempel, dyp reaktiv ioneetsing, elektronstråle-litografi, direkte laserutskrift, femtosecond laser, fotolitografi og plasma tørretsing ^18. Disse metodene er ofte tidkrevende, krever komplisert apparatur og kan være begrensende i form av mønsteret generert. I tillegg har de ikke synkronisere mønster med bioprinting og ikke tillate for umiddelbar cellularization. Den koordinert bevegelse styres av en automatiskutleveringssystemet kan følge komplekse mønstre for avsetningen av løsninger. Her viser vi hvordan mikroskala-styrt bevegelse kan utnyttes til å skape kanaler for cellen orientering. En skjerpet pennen eller skalpell er festet til skrivehodet i stedet for ekstrudering sprøyten og utstyret kan så etse polymeroverflaten under veiledning av plotte programvare. Fremgangsmåten gir allsidighet i mønsterdesign og er anvendelig til polymere materialer som vanligvis brukes i bioteknologi, slik som polystyren, PTFE, og polykaprolakton. Som et etterfølgende trinn til den etsing, kan celler bioprinted direkte til oppskrapte sporene. Den gelatin bioink benyttet her var i stand til både å opprettholde sporet og la avsatt celler til å oppfatte de etset funksjoner. Stamceller bioprinted til etset sporene ble vist å forlenge langs dem i forskjellige linjer.

Protocol

NB: Denne protokollen beskriver anvendelsen av et mottrykk assistert robotdispenseringssystem (figur 1A) som et overflateetsing (figur 1B) og ekstrudering-baserte bioprinter (figur 1C) 10. 1. Endring av en polystyren Surface Bruk 1 mm isopor plater siden polystyren vevskulturplater en tendens til å bøye seg oppover i sentrum, ødelegger høyden konsistensen av både etsing og utskrift. MERK: Som polystyren arke…

Representative Results

De representative resultater viser at mottrykket assistert robotdoseringssystemet kan brukes som en ekstrudering-baserte bioprinter for å utføre både overflateetsing og bioink trykking (figur 1 A). Den kan brukes for generering av etsede spor i polymeroverflater, og deretter å skrive ut en celle lager bioink direkte til trekkene (figur 1 B og C). Både etsing og utskrift bestemmes av de pr…

Discussion

Den kritiske trinn i denne prosedyren er selve bioprinting levering av stamceller som prosessen må tillate celle sedimente til funksjoner, skrives ut uten bioink spredning / blødninger, leverer celler uten skjærspenninger celledød og ikke utløser differensiering mot uønsket avstamning.

Dersom forventet celle justeringen mislykkes å skje, så bioink viskositet bør vurderes for sin egnethet for utskrift. Det er viktig at den bioink gjør det mulig for cellene å sedimentere til den mø…

Materials

Equipment
Robotic Dispensing System	Janome	2300N
Plasma Machine	Femto Science	Covance
USB Microscope
Optical Microscope	Olympus	IX71
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Spreadsheet	Excel	Excel
Printing Co-ordinate Software	Janome	JR C-Points
Imaging Software	National Institutes of Health (NIH)	ImageJ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Stylus (Blade)	OLFA	AK-5
5ml printing syringe	San-ei Tech	SH10LL-B
30G printing needle	San-ei Tech	SH30-0.25-B
1mm polystyrene sheets		Purchased locally
Fetal bovine serum	Invitrogen	10270-098
Phosphate buffered saline	Invitrogen
Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A	Sigma Aldrich	9000-70-8
αMEM	Invitrogen	41061-029
Antibiotc antimycotic	Sigma Aldrich	A5955-100ML
Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs)	Cyagen Biosciences Incorporation	RASMX-01201