Técnica robótica automatizada de dispensación de Orientación de la superficie de las células y Bioprinting
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
Este manuscrito describe la introducción de características de orientación celular seguido de la entrega directa de las células de estas características en un bioink hidrogel usando un sistema de dispensación robótico automatizado. Se seleccionó la bioink particular, ya que permite que las células se sedimentan hacia y detectan las características. El sistema de distribución bioprints células viables en bioinks de hidrogel utilizando un cabezal de impresión contrapresión asistida. Sin embargo, mediante la sustitución de la cabeza de impresión con un lápiz o un bisturí afilado, el sistema de dispensación puede también ser empleado para crear señales topográficas a través de ataque químico de la superficie. El movimiento de la aguja se puede programar en pasos de 10 micras en los ejes X, Y y Z. Las ranuras estampadas fueron capaces de orientar las células madre mesenquimales, influir en ellos para adoptar una morfología alargada en alineación con la dirección de las ranuras. El patrón podría ser diseñado utilizando software de trazado de líneas rectas, círculos concéntricos, y las ondas sinusoidales. En un procedimiento posterior, fibroblastos y células madre mesenquimales se suspendieron en un bioink gelatina 2%, para bioprinting en una contrapresión impulsado cabezal de impresión de extrusión. El bioink rodamiento celular a continuación, se imprime usando las mismas coordenadas programadas utilizados para el grabado. Las células bioprinted fueron capaces de detectar y reaccionar a las características grabadas como se demuestra por su orientación alargada a lo largo de la dirección de las ranuras grabadas.
Introduction
El patrón deliberada de colocación celular permite la formación de las culturas que imitan in vivo organización celular 1. De hecho, la investigación sobre la interacción entre múltiples tipos de células puede ser asistido por la organización de su situación espacial 2,3. La mayoría de los sistemas de modelado se basan en procedimientos de modificación de superficie para promover o prevenir la adhesión celular con la deposición de células pasiva posterior. Bioprinting ofrece un control espacial y temporal sobre la distribución de la celda 1. Además de estas funciones, bioprinting ha sido descrita como un método técnicamente sencilla, rápida y rentable para la generación de andamios geométricamente complejas 4. Se utiliza el software de diseño por ordenador y permite la introducción de células en el proceso de fabricación 4.
Sistemas Bioprinting se han clasificado sobre la base de sus principios de trabajo como el láser basados, a base de inyección de tinta o de extrusión de base 4. Bioprinting de extrusión ha sido descrito como el más prometedor, ya que permite la fabricación de construcciones organizadas de tamaños clínicamente relevantes dentro de un marco de tiempo realista 4-6. Se lleva a cabo por cualquiera de presión mecánica o la parte posterior de extrusión asistida de un hidrogel bioink cojinete celular. En el método que aquí se presenta, se empleó la contrapresión. Como se ha mencionado, las células se entregan en un bioink citocompatible. Tal bioink debe apoyar la entrega de las células sin producir tensión de corte deletérea, y ser de una viscosidad suficiente para mantener la integridad de la huella impresa, sin colapsar o propagar (referido como "corrimiento de la tinta") 7-10.
La interacción de las células con su superficie adherente se sabe que influyen en el comportamiento celular. La topografía de la superficie se puede controlar la forma de la célula, la orientación 11, e incluso el fenotipo. En particular, la fabricación de ranuras y canales se han demostrado para inducirun estirado, morfología alargada en múltiples tipos de células. La adopción de esta morfología se ha encontrado para influir en el fenotipo de las células multipotentes y pluripotentes. Por ejemplo, cuando se alinea en ranuras, las células madre mesenquimales (MSC) mostrar evidencia de diferenciación hacia cardiomiocitos 12,13 y células musculares lisas vasculares adoptar el fenotipo contráctil sobre el sintético 10,14-17.
La célula de la alineación de canales o ranuras puede ser generada en una superficie polimérica a través de una serie de métodos, por ejemplo, en el fondo de ataque químico iónico reactivo, la litografía por haz de electrones, la impresión láser directa, láser de femtosegundo, fotolitografía y grabado en seco plasma 18. Estos enfoques son a menudo mucho tiempo, requieren un aparato complejo y puede ser limitante en la forma del patrón generado. Además, no se sincroniza con el patrón bioprinting y no permiten cellularization inmediata. El movimiento coordinadamente controlada de un automatizadosistema de dispensación puede seguir patrones complejos para la deposición de soluciones. Aquí demostramos cómo el movimiento microescala controlado puede ser explotada para crear canales para la orientación de la celda. Un lápiz o escalpelo afilado se encuentra junto a la cabeza de impresión en lugar de la jeringa de extrusión y el equipo se pueden grabar la superficie del polímero bajo la dirección del software de trazado. El método ofrece versatilidad en el diseño patrón y es aplicable a materiales poliméricos usados comúnmente en la bioingeniería, tales como poliestireno, PTFE, y policaprolactona. Como paso posterior al ataque químico, las células pueden bioprinted directamente a las ranuras rayados. El bioink gelatina utilizada aquí fue capaz de mantener tanto la traza y permitir que las células depositadas al sentido las características grabadas. Las células madre mesenquimales bioprinted a las ranuras grabadas se demostraron para alargar lo largo de ellos en líneas distintas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El paso fundamental de este procedimiento es la entrega bioprinting real de las células madre ya que el proceso debe permitir la sedimentación de células a las características, imprimir sin bioink difusión / sangrado, entregar las células sin la muerte celular esfuerzo de corte y no desencadenar la diferenciación hacia el linaje no deseado.
Si la alineación de celdas esperado no se produce, entonces la viscosidad bioink, se debe evaluar su idoneidad para la impresión. Es importante …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
References
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