Роботизированная Дозирование Техника для ориентации поверхности и Bioprinting клеток
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
Эта рукопись описывает введение функций клеток наведения с последующей прямой доставки клеток к этим функциям в гидрогеле bioink с использованием автоматизированной роботизированной системы дозирования. Частности bioink был выбран, поскольку это позволяет клеткам оседать в сторону и почувствовать особенности. Система дозирования bioprints жизнеспособных клеток в гидрогелевых bioinks используя противодавлении помощь печатающей головки. Тем не менее, путем замены печатающей головки с заостренным пером или скальпель, система дозирования может также быть использован для создания топографические сигналы путем травления поверхности. Движение стилуса может быть запрограммирован с шагом 10 мкм в X, Y и Z.. Узорчатые канавки были способны сориентировать мезенхимальные стволовые клетки, влияя на их принять удлиненную морфологию в соответствие с направлением канавок. Структурирование может быть разработан с использованием построения программного обеспечения в прямых линий, концентрических кругов и синусоидальных волн. В последующей процедуре, фиброзноВзрывы и мезенхимальные стволовые клетки суспендировали в 2% желатина bioink, для bioprinting в противодавления приводом экструзионной головки. Клетка подшипник bioink затем распечатаны с использованием тех же запрограммированным координаты, используемые для травления. В bioprinted клетки были способны воспринимать и реагировать на протравленных черты, как продемонстрировано их удлиненным ориентации вдоль направления протравленных канавок.
Introduction
Преднамеренное структурирование размещения клеток способствует формированию культур , которые имитируют в естественных условиях клеточной организации 1. Действительно, исследование взаимодействия между несколькими типами клеток может быть оказана помощь путем организации их пространственного размещения 2,3. Большинство систем паттерна полагаются на процедуры модификации поверхности для содействия или предотвращения адгезии клеток с последующим пассивным осаждением клеток. Bioprinting предлагает пространственную и временную контроль над распределений клеток 1. В дополнение к этим функциям, bioprinting был описан как технически простой, быстрый и экономически эффективный способ для формирования геометрически сложных строительных лесов 4. Он использует разработки программного обеспечения компьютера и позволяет введение клеток в процессе изготовления 4.
Системы Bioprinting были отнесены к категории основаны на их принципах работы как лазер на основе, для струйной печати на основе или экструзии на основе 4, Экструзионная bioprinting был описан как наиболее перспективным , поскольку оно позволяет изготовление организованных конструкций клинически значимых размеров в реалистичные сроки 4-6. Она выполняется либо механическим или обратного давления при содействии экструзии гидрогеля bioink клеток подшипника. В способе, представленном здесь, использовали обратное давление. Как уже упоминалось, клетки доставляются в cytocompatible bioink. Такой bioink должна поддерживать доставку клеток , не вызывая вредного напряжения сдвига, и иметь достаточную вязкость , чтобы сохранить целостность печатного следа, без разрушения или распространения (упоминаемый как "чернила просачиваться") 7-10.
Взаимодействие клеток с их липкого поверхности, как известно, влияют на клеточное поведение. Рельеф поверхности может контролировать форму клеток, ориентации 11, и даже фенотип. В частности, изготовление пазов и каналов было продемонстрировано, чтобы побудитьрастянутая, удлиненная морфология на нескольких типах клеток. Применение данной морфологии было обнаружено, что влияние на фенотип мультипотентных и плюрипотентных клеток. Например, при выравнивании по канавкам, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , показывают доказательства дифференциации по отношению к кардиомиоцитов 12,13 и клеток гладкой мускулатуры сосудов принимают сократительную фенотип над синтетическим 10,14-17.
Клетка совместив каналы или канавки могут быть сформированы на полимерной поверхности с помощью ряда способов, например, глубоко реактивное ионное травление, литография электронный луч, прямой лазерной печати, фемтосекундного лазерного, фотолитографии и плазменного сухого травления 18. Эти подходы часто отнимает много времени, требует сложной аппаратуры и может быть ограничение в виде узора генерируемой. Кроме того, они не синхронизируются с bioprinting кучность и не позволяют к немедленному cellularization. Координационно контролируемое движение автоматизированнойсистема дозирования может следовать сложные шаблоны для осаждения растворов. Здесь показано, как движение микромасштабная под контролем может быть использована для создания каналов для клеточной ориентации. Заостренную стилус или скальпель прикреплен к печатающей головке вместо экструзионной шприца и оборудование может затем протравить поверхность полимера под руководством программного обеспечения черчения. Метод обеспечивает универсальность в конструкции картины и применима к полимерным материалам, обычно используемых в биоинженерии, таких как полистирол, PTFE, и поликапролактон. В качестве следующей стадии к травлению, клетки могут быть bioprinted непосредственно к поцарапанном канавками. Желатин bioink используется здесь был в состоянии поддерживать как след и позволяют осажденные клетки ощутить Протравленная черты. Мезенхимальные стволовые клетки bioprinted к протравленных канавок были продемонстрированы удлиняться вдоль них в различных линиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важным шагом этой процедуры является фактическая поставка bioprinting стволовых клеток, поскольку процесс должен позволять оседания клеток с признаками, печать без bioink распространения / кровотечение, доставляют клетки без сдвига смерти стресс клеток и не вызывают дифференциацию по отноше…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
References
- Ma, Z., Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P., et al. . Cell and Organ Printing. , 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 123-152 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Skardal, A., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 1-17 (2015).
- Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).
- Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
- Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
- Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
- Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
- Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
- Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
- Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).
- Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
- Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
- Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
- Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
- Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Merceron, T. K., Murphy, S. V., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 249-270 (2015).
- Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 229-248 (2015).
- Lee, K. V., Turksen, K., et al. . Bioprinting in Regenerative Medicine. , 33-66 (2015).
- Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
- Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
- Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
- Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).
- Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).
- Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels – The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
