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Immunology and Infection

유학을위한 방법론<em> B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로> 바이오 필름

Published: October 09, 2016
doi:
10.3791/54612
, ,
1Department of Molecular Genetics,Weizmann Institute of Science, 2Electron Microscopy Unit,Weizmann Institute of Science

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

다세포 세균 지역 사회는 자연 및 인위적 환경에서 중요한 역할을하고, 유익하거나 매우 유해 할 수 있습니다. 이러한 다세포 콜로니 개별 세포 자체 생산 세포 외 폴리머 물질 (EPS) 매트릭스에 매립되는 것을 특징으로하는 바이오 필름으로서 알려져있다. 허가제 강하게들이 정착 표면에 세포를 접착. 그들은 기계적 및 화학적 힘에 대항하는 방패 역할 및 셀룰러 통신 1을 촉진, 인접 셀 사이에 긴밀한 연락을 만듭니다. 생물막은 세포가 고도로 규제 사용하십시오 차별화 된 커뮤니티로 볼 수있다, 종 2-5에서뿐만 아니라, 지역 사회 내에서 활동을 조정하는 프로세스를 조율. 생물막 상태로 성장 플랑크톤 자유 생활 모드 간의 전환은 종종 개발 프로세스와 관련된다. 좋은 예는 그람 양성 토양 박테리아 고초균 및 따라서 인 undomesticated 균주는 biofilm 형성을 유도하는 발달 단계를 연구하는 강력한 모델 생물 역할을한다. 이 박테리아에서, 운동성 세포는 전문적인 작업 4를 수행 눈에 띄는 다세포 구조로 자신을 구성 할 수 있습니다. 셀들의 하나의 그룹은 매트릭스 생산자 엑소 폴리 사카 라이드 6 분비 아밀로이드 단백질 TASA 7,8, 표면 소수성 단백질 BslA 9,10; 이는 모두는 EPS 11-13의 조립에 참여한다.

자연스럽고 인위적 틈새에 생물막의 풍부하고 일으킬 수있는 치명적인 손상 추정을 감안할 때, 그 형성을 방지하는 방법을 찾기 위해 가압 할 필요가있다. 소분자 억제제는 새로운 규제 경로, 효소 및 생물막 형성에 관여하는 구조 단백질의 발견에 도움이, 이에 다세포 커뮤니티 어셈블리의 복잡한 프로세스의 통찰을 촉진 할 수있다. B.으로 서브 틸리는 바이오 잘 연구 된 모델입니다성막 14,15, 다양한 생물막 억제제의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 연구는 작은 분자 억제제에 바이오 필름의 반응을 평가하기위한 중요한 4 개의 기본적인 방법을 다룹니다. 첫째,이 억제제는 생물막 특정 대상이 있는지 확인하기 위해, biofilm 형성에 미치는 영향에서 플랑크톤의 성장에 미치는 영향의 분리는 매우 중요하다. 대부분의 항균제는 플랑크톤 성장기에있는 세포를 표적으로하지만, 생물막 라이프를 대상 분자는 드물다. 플랑크톤의 성장에 영향을 미치지 않는 분자 독성이기 때문에 또한 이들은 항생제 내성 돌연변이 체 (16)를 선호 선택 압력을 감소시킬 수있다. 바이오 필름은 D 아미노산 또는 기타 특정 세포벽 간섭 분자로 처리하는 경우, 예를 들면, 그들은 어느 방해하거나 분해하지만, 이러한 억제제는 약간 플랑크톤 성장 12,17 영향을한다. 대조적으로, 많은 항생제 극적 리터와 플랑크톤 성장을 저해ittle 또는 biofilm 형성 (17)에 아무런 영향.

둘째, 작은 분자의 효과를 연구하는 일관되고 견고한 실험 프레임 워크를 확립하는 것이 중요하다. 우리는 소분자 억제제의 활성 농도 범위는 예비 배양 조건 이러한 소분자 저해제의 효과를 연구하기 위해 실험 구성에 민감한 것을 관찰 하였다. 특히이 B를 공부 각종 보고서, 부유 세균 바이오 필름 12,17-19 – 서브 틸리는 D-아미노산 펠리클의 형성을 억제하는 농도 범위의 변화를 한 것으로 밝혀졌습니다. 여기에 제시된 결과는 다음과 같은 요소가 활성 농도 범위의 차이를 고려하는 것이 제안 : 예비 배양 조건 (후기 정지 20 성장기 대 로그 12,17) 예비 배양 조건에서 사용 된 배양 배지는 (풍부 정의 대 정의되지 않은 [루리아 국물, LB] [글루탐산 나트륨글리세롤, MSgg), 접종 비 접종 전의 상기 배지 특히 제거. 정적 펠리클의 성장 온도는 소분자 억제제 D 류신, 본 연구에 사용 된 대표 D 아미노산의 활성 영역에서 덜 중요한 역할을 나타내었다.

마지막으로, 한 번 생물막은 특정 바이오 필름 억제제, 강력하고 유익한 방법이 생물막 피트니스 이러한 억제제의 효과를 특성화하기 위해 필요로 처리됩니다. 생물막 콜로니 및 항균제 그들의 저항 내 단일 세포 (1) 효과 : 여기서, 독립적 소분자 억제제의 효과를 특징 화하는 두 가지 방법이 상세히 설명된다. 자유 살아있는 박테리아 21-23에 비해 생물막의 셀은 전형적으로 더 많은 항생제 내성한다. 이 현상은 인성이지만, 항생제 침투를 줄이기위한 EPS의 능력은 종종 매력 설명 24 여겨졌다 </suP>. 이 방법은 항균성 물질에 노출 된 후 미리 설정된 생물막 세포의 생존율을 평가한다. (2) 작은 규모에 큰에서 생물막 식민지 아키텍처에 미치는 영향. 생물막 콜로니는 입체 구조와 EPS의 존재를 특징으로한다. 주사 전자 현미경을 이용하여, 세포 형태, 생물막 콜로니 구조 및 EPS의 구조 및 다량의 변화는 작은 크기 (μm의)에 큰 (mm)에서 가시화 될 수있다.

Protocol

1. 펠리클과 바이오 필름 콜로니 형성에 작은 분자 억제제의 효과 평가 칼슘 염화 철 (III) 클로라이드 수화물없이 정의 생물막 유도 MSgg 매체 (25)의 2 배 솔루션을 준비합니다. 여과 멸균 한 후, 염화칼슘을 추가한다. 매체는 직접적으로 사용할 준비가되거나 어둠 속에서 4 ℃에서 저장 될 수있다. 실험의 날에 1 배 MSgg 희석을 준비합니다. (멸균 증류수 (펠리클) 또는 멸…

Representative Results

펠리클 분석은 B의 높은 규제 및 동적 프로세스를 연구하는 하나의 방법이다 서브 틸리 다세포. 이 외에, 펠리클 분석 한 실험에서 단일 세포 배양 multidish 접시에 미리 시동 조건 또는 소분자 어느 농도의 범위를 테스트하는 데에 적합하다. 그러나, B. 서브 틸리 펠리클 형성은 예비 배양 조건에 민감하다 (예를 들어, 예비 – 배양의 성장 배지 및 성장 단계) 접종 비와 미리…

Discussion

바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 형태 강력하고 고도로 구조화 된 생물막 모두 액체 (펠리클)와 고체 배지에 (식민지). 따라서, 특정 바이오 필름 저해제의 작용 모드를 특성화하는 이상적인 모델 생물로서 기능한다. 고체 배지에서 세포 가장자리에 중심에서 방사 주름 등 펠리클에서 알 수없는 고유 한 특징을 가진 다세포 구조를 형성한다. 따라서, 펠리클과 식민지 B.을 연구 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation – Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

Materials

Luria Broth, Lennox Difco 240230
Bacto Agar Difco 214010
potassium phosphate monobasic  Sigma, 136.09 g/mol P0662-500G
potassium phosphate dibasic  Fisher Scientific, 174.18 g/mol BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Fisher Scientific, 209.27 g/mol BP308-500
magnesium chloride hexahydrate  Merck, 203.30 g/mol  1.05833.0250
calcium chloride anhydrous J.T. Baker, 110.98 g/mol 1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma, 197.91 g/mol 31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate  Sigma, 270.30 g/mo) F2877-500G
zinc chloride anhydrous  Acros Organics, 136.29 g/mol 424592500
thiamine hydrochloride Sigma, 337.27 g/mol T1270-100G
L-tryptophan Fisher Scientific, 204.1 g/mol BP395-100
L-phenylalanine Sigma, 165.19 g/mol P5482-100G
L-threonine Sigma, 119.12 g/mol T8625-100G
glycerol anhydrous Bio-Lab Itd 712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate  Sigma, 169.11 g/mol G1626-1KG
D-leucine Sigma, 169.11 g/mol 855448-10G
ethanol anhydrous Gadot 830000054
razor blade Eddison NA
circular cellulose filter papers Whatman, 90 mm 1001-090
glutaraldehyde EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water 16220
paraformaldehyde  EMS, 16% in water 15710
sodium cacodylate Merck, 214.05 g/mol  8.2067
calcium chloride 2-hydrate Merck, 147.02 g/mol  1172113
stub-aluminium mount EMS, sloted head 75230
carbon adhesive tape EMS 77825-12
Shaker 37°C New Brunswick Scientific Innowa42 NA
Centrifuge Eppendorf table top centrifuge 5424 NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip Branson NA
Incubator 30 °C Binder NA
Incubator 23 °C Binder NA
Filter System, 500 ml, polystyrene Cornig Incorporated NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II Boekel NA
S150 Sputter Coater  Edwards NA
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC NA
Environmental Scanning Electron Microscope XL30 ESEM FEG Philips (FEI) NA
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References

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Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. J. Vis. Exp. (116), e54612, doi:10.3791/54612 (2016).
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