Metodologias para o estudo<em> B. subtilis</em> Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

comunidades bacterianas multi-celulares desempenham papéis importantes em ambientes naturais e antropogênicas, e pode ser benéfica ou altamente prejudicial. Estas colónias multi-celulares são conhecidos como biofilmes, em que as células individuais são embutidos em um (EPS) de matriz extracelular substâncias poliméricas auto-produzido. Os EPS aderir fortemente as células à superfície, eles colonizam. Eles servem como um escudo contra as forças mecânicas e químicas e criar contacto próximo entre as células vizinhas, facilitando a comunicação celular ^1. Um biofilme pode ser visto como uma comunidade diferenciada, em que as células usam altamente regulado, orquestrada processos para coordenar as suas actividades no seio da comunidade, bem como entre espécies ^2-5. A transição de uma planctônicas, o modo de vida livre do crescimento a um estado de biofilme é frequentemente associada com os processos de desenvolvimento. Um bom exemplo é o Bacillus subtilis bactéria do solo Gram-positivas, e, portanto, uma undomeestirpe sticated serve como um organismo modelo robusto para estudar os estágios de desenvolvimento que conduzem a formação de biofilme. Nesta bactéria, células móveis se organizam em estruturas multicelulares conspícuos que realizam tarefas especializadas ^4. Um grupo de células, a matriz-produtores secretam exopolissacáridos ^6, a proteína amilóide tasa ^7,8, e a proteína de hidrofobicidade da superfície BslA ^9,10; todos os que participam da montagem dos EPS ^11-13.

Dada a abundância de biofilmes em nichos naturais e antrópicos e os danos fatais putativo eles podem causar, há uma necessidade premente de encontrar formas de prevenir a sua formação. inibidores de moléculas pequenas podem auxiliar na descoberta de novas vias reguladoras, enzimas e proteínas estruturais envolvidas na formação de biofilme, e, assim, promover insights os complexos processos de montagem comunidade multicelular. Como B. subtilis é um modelo bem estudado para bioformação de película ^14,15, ele pode ser usado para avaliar os efeitos de vários inibidores de biofilme. Este estudo aborda quatro métodos fundamentais que são a chave para avaliar a resposta de biofilmes a inibidores de pequenas moléculas. Em primeiro lugar, para assegurar que estes inibidores têm um alvo específico do biofilme, a separação do efeito sobre o crescimento planctônicas de o efeito sobre a formação de biofilme é crítica. A maioria dos agentes antibacterianos como alvo as células em sua fase de crescimento planctônicas, mas as moléculas que têm como alvo o estilo de vida biofilme são raros. Além disso, como as moléculas que não afectam o crescimento planctônicas não são tóxicos, podem reduzir a pressão selectiva favorecendo mutantes resistentes a antibióticos ^16. Por exemplo, quando biofilmes são tratados com D-aminoácidos ou determinadas outras moléculas interferentes da parede celular, eles são ou perturbada ou desmontado, mas estes inibidores apenas afectam moderadamente ^12,17 crescimento planctônicas. Em contraste, muitos antibióticos prejudicar drasticamente o crescimento planctônicas, com little ou nenhum efeito sobre a formação de biofilme ^17.

Em segundo lugar, que estabelece um quadro experimental consistente e robusta para estudar o efeito de as moléculas pequenas é crucial. Observou-se que o intervalo de concentração activa de inibidores de moléculas pequenas era sensível às condições de pré-cultura e para a instalação experimental utilizada para estudar o efeito destes inibidores de moléculas pequenas. Vários relatórios, particularmente aqueles que estudam B. subtilis, revelou variações no intervalo de concentrações em que D-aminoácidos inibem a formação de películas – as flutuantes biofilmes bacterianas ^12,17-19. Os resultados aqui apresentados sugerem que os seguintes fatores em conta as diferenças na faixa de concentração ativa: as condições pré-cultura (logarítmica ^12,17 ante fase de ²⁰ crescimento tardio-estacionária), o meio de crescimento utilizada na condição de pré-cultura (rico, indefinido [Caldo de Luria, LB] versus definido [glutamato monossódico-glicerol, MSgg]), a proporção da inoculação e, especialmente, a remoção do meio de pré-cultura antes da inoculação. A temperatura de crescimento da película estática mostrou um papel menos importante na gama do inibidor de molécula pequena de D-leucina, uma D-aminoácido representativa utilizada neste estudo a actividade.

Finalmente, uma vez que os biofilmes são tratados com inibidores específicos de biofilme, métodos robustos e informativas são necessários para caracterizar os efeitos destes inibidores sobre a aptidão do biofilme. Aqui, dois métodos para caracterizar de forma independente do efeito de inibidores de moléculas pequenas são descritos em detalhe: (1) O efeito sobre as células individuais dentro de uma colónia de biofilme e a sua resistência a agentes antimicrobianos. As células em biofilmes são tipicamente mais resistentes a antibióticos quando comparado com as bactérias de vida livre ^21-23. Embora este fenómeno é multifactorial, a capacidade do EPS para reduzir a penetração de antibiótico foi muitas vezes considerado como uma explicação atraente ²⁴ </sup>. Este método avalia a sobrevivência de células do biofilme pré-estabelecido após a exposição a substâncias antibacterianas. (2) O efeito sobre a arquitectura do biofilme colónia, a partir da grande para a pequena escala. colónias de biofilme são caracterizados pela sua estrutura tridimensional e a presença do EPS. Utilizando microscopia eletrônica de varredura, as alterações na morfologia celular, estrutura da colônia de biofilme e a arquitetura e abundância das EPS pode ser visualizado a partir do grande (mm) para a pequena escala (mm).

Protocol

1. Avaliar o efeito de pequenas moléculas inibidores de Película e formação de biofilme Colony Prepara-se uma solução de meio de indução de biofilme MSgg definido 2x 25 sem o cloreto de cálcio e ferro (III), cloreto de hexa-hidrato. Após a esterilização do filtro, adicionar o cloreto de cálcio. O meio é pronto para usar directamente ou pode ser armazenado a 4 ° C no escuro. Preparar uma diluição 1x MSgg no dia da experiência. Dilui-se o meio 2x MSgg para 1x com …

Representative Results

O ensaio de película é um método para estudar os processos altamente regulados e dinâmicas de B. multicelularidade subtilis. Além disso, o ensaio de película é adequado para testar uma gama de condições, quer pré-inicial ou concentrações de moléculas pequenas em uma placa de cultura de células multidish único numa experiência. No entanto, B. subtilis formação de película é sensível às condições de pré-cultura (por exemplo, o meio de crescimento de pré-cultura…

Discussion

Bacillus subtilis formas robustas e altamente estruturados biofilmes ambos no estado líquido (películas) e em meio sólido (colônias). Por isso, serve como um organismo modelo ideal para a caracterização do modo de acção dos inibidores específicos de biofilme. Em meio sólido, as células formam estruturas multicelulares com características distintas que não são evidentes em películas, como rugas que irradiam do centro para a borda. Assim, películas e colônias são sistemas complementares para est…

Materials

Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher Scientific, 209.27 g/mol	BP308-500
magnesium chloride hexahydrate	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
calcium chloride anhydrous	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate	Sigma, 270.30 g/mo)	F2877-500G
zinc chloride anhydrous	Acros Organics, 136.29 g/mol	424592500
thiamine hydrochloride	Sigma, 337.27 g/mol	T1270-100G
L-tryptophan	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-phenylalanine	Sigma, 165.19 g/mol	P5482-100G
L-threonine	Sigma, 119.12 g/mol	T8625-100G
glycerol anhydrous	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
ethanol anhydrous	Gadot	830000054
razor blade	Eddison	NA
circular cellulose filter papers	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaraldehyde	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water	16220
paraformaldehyde	EMS, 16% in water	15710
sodium cacodylate	Merck, 214.05 g/mol	8.2067
calcium chloride 2-hydrate	Merck, 147.02 g/mol	1172113
stub-aluminium mount	EMS, sloted head	75230
carbon adhesive tape	EMS	77825-12
Shaker 37°C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuge	Eppendorf table top centrifuge 5424	NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip	Branson	NA
Incubator 30 °C	Binder	NA
Incubator 23 °C	Binder	NA
Filter System, 500 ml, polystyrene	Cornig Incorporated	NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
CPD 030 Critical Point Dryer	BAL-TEC	NA
Environmental Scanning Electron Microscope	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA