Metodologías para el estudio<em> B. subtilis</em> Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

comunidades bacterianas multicelulares juegan un papel importante en entornos naturales y antropogénicos, y pueden ser beneficiosos o perjudiciales altamente. Estas colonias multicelulares se conocen como las biopelículas, en donde las células individuales están incrustadas en un (EPS) matriz de sustancias poliméricas extracelulares de producción propia. Los EPS se adhieren fuertemente a las células a la superficie que colonizan. Ellos sirven como un escudo contra las fuerzas mecánicas y químicas y crean un estrecho contacto entre las células vecinas, lo que facilita la comunicación celular ^1. Una biopelícula puede ser vista como una comunidad diferenciada, donde las células uso altamente regulados, procesos orquestada para coordinar sus actividades dentro de la comunidad, así como en todas las especies ^2-5. La transición de un planctónicas, el modo de vida libre de crecimiento a un estado de biopelícula se asocia a menudo con los procesos de desarrollo. Un buen ejemplo es la bacteria del suelo Bacillus subtilis Gram-positivas, y por lo tanto, una undomecepa sticated sirve como un modelo sólido organismo para estudiar las etapas de desarrollo que conducen a la formación de biopelículas. En esta bacteria, células móviles se organizan en estructuras multicelulares visibles que llevan a cabo tareas especializadas ^4. Un grupo de células, la matriz-productores secretan exopolisacáridos ^6, la proteína amiloide TASA ^7,8, y la proteína de hidrofobicidad de la superficie BSLA ^9,10; todos los cuales participan en el montaje de las EPS ^11-13.

Dada la abundancia de biopelículas en nichos naturales y antropogénicos y el daño fatal putativa que pueden causar, hay una necesidad urgente de encontrar formas de prevenir su formación. inhibidores de moléculas pequeñas pueden ayudar en el descubrimiento de nuevas rutas reguladoras, enzimas y proteínas estructurales que participan en la formación de biopelículas, y por lo tanto promover puntos de vista en los complejos procesos de montaje comunidad multicelular. Como B. subtilis es un modelo bien estudiado para bioformación de película ^14,15, que puede ser utilizado para evaluar los efectos de varios inhibidores de biopelículas. Este estudio fuerza a cuatro métodos fundamentales que son clave para evaluar la respuesta de las biopelículas a los inhibidores de moléculas pequeñas. En primer lugar, para asegurar que estos inhibidores tienen un objetivo del biofilm específica, la separación del efecto sobre el crecimiento planctónicas del efecto sobre la formación de biopelículas es crítica. La mayoría de los agentes antibacterianos dirigen a las células en su fase de crecimiento del plancton, pero las moléculas que se dirigen a la forma de vida de biopelículas son raros. Adicionalmente, como moléculas que no afectan el crecimiento planctónica no son tóxicos, pueden reducir la presión selectiva que favorece mutantes resistentes a los antibióticos ^16. Por ejemplo, cuando biofilms se tratan con D-aminoácidos o ciertas otras moléculas pared interferir celular, o bien son perturbados o desmontados, pero estos inhibidores sólo afectan ligeramente ^12,17 crecimiento planctónicas. Por el contrario, muchos antibióticos alteran dramáticamente el crecimiento del plancton, con little o ningún efecto sobre la formación de biopelículas ^17.

En segundo lugar, se establece un marco experimental consistente y robusta para estudiar el efecto de las moléculas pequeñas es crucial. Hemos observado que el intervalo de concentración activa de inhibidores de moléculas pequeñas era sensible a las condiciones de pre-cultivo y para la configuración experimental utilizada para estudiar el efecto de estos inhibidores de molécula pequeña. Varios informes, en particular los que estudian B. subtilis, reveló variaciones en el rango de concentración en la que D-aminoácidos inhiben la formación de unas películas – las biopelículas bacterianas flotantes ^12,17-19. Los resultados presentados aquí sugieren que los siguientes factores explican las diferencias en el rango de concentración activa: las condiciones de pre-cultivo ^(12,17 logarítmica frente fase de crecimiento del ^{20-estacionaria} tardía), el medio de cultivo utilizado en la condición de pre-cultivo (rico, indefinido [caldo Luria, LB] frente define [glutamato monosódicoglicerol, MSgg]), la relación de la inoculación y, especialmente, la eliminación del medio de pre-cultivo antes de la inoculación. La temperatura de crecimiento de película estática mostró un papel menos importante en la gama de actividad de la inhibidor de molécula pequeña D-leucina, un ácido D-amino representativo utilizado en este estudio.

Por último, una vez que las biopelículas son tratados con inhibidores específicos de biopelícula, se requieren métodos robustos e informativas para caracterizar los efectos de estos inhibidores sobre la aptitud de biopelículas. Aquí, se describen dos métodos para caracterizar de forma independiente el efecto de inhibidores de moléculas pequeñas en detalle: (1) El efecto sobre las células individuales dentro de una colonia biofilm y su resistencia a los agentes antimicrobianos. Las células en las biopelículas son típicamente más resistentes a los antibióticos en comparación con bacterias de vida libre ^21-23. Aunque este fenómeno es multifactorial, la capacidad de los EPS para reducir la penetración de antibióticos se considera a menudo como una explicación atractiva ²⁴ </sup>. Este método evalúa la supervivencia de las células del biofilm preestablecidos después de la exposición a las sustancias antibacterianas. (2) El efecto sobre la arquitectura colonia biofilm, de la gran a la pequeña escala. colonias Biofilm se caracterizan por su estructura tridimensional y la presencia de los EPS. Utilizando microscopía electrónica de barrido, los cambios en la morfología celular, estructura colonia biofilm y la arquitectura y la abundancia de los EPS se pueden visualizar desde la grande (mm) a la pequeña escala (micras).

Protocol

1. Evaluar el efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas en Pellicle y la formación de biopelículas Colonia Preparar una solución 2x de medio de 25 MSgg biofilm inductor definido sin el cloruro de calcio y de hierro (III) hexahidrato de cloruro. Después de la esterilización del filtro, añadir el cloruro de calcio. El medio está listo para usar directamente o se puede almacenar a 4 ° C en la oscuridad. Preparar la dilución 1x MSgg en el día del experimento. Diluir…

Representative Results

El ensayo de película es un método para estudiar los procesos altamente regulados y dinámicas de B. pluricelularidad subtilis. Además de esto, el ensayo de película es adecuado para ensayar una serie de cualquiera de las condiciones pre-arranque o pequeñas concentraciones de moléculas en una placa única multiplaca de cultivo celular en un experimento. Sin embargo, B. formación de película subtilis es sensible a las condiciones de pre-cultivo (por ejemplo, medio de c…

Discussion

Bacillus subtilis formas robustas y altamente estructurados biopelículas tanto en estado líquido (unas películas) y en medio sólido (colonias). Por lo tanto, sirve como un organismo modelo ideal para caracterizar el modo de acción de los inhibidores de biopelículas específicas. En medio sólido, las células forman estructuras multicelulares con rasgos distintivos que no son evidentes en unas películas, como las arrugas que irradian desde el centro hasta el borde. Por lo tanto, unas películas y las col…

Materials

Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher Scientific, 209.27 g/mol	BP308-500
magnesium chloride hexahydrate	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
calcium chloride anhydrous	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate	Sigma, 270.30 g/mo)	F2877-500G
zinc chloride anhydrous	Acros Organics, 136.29 g/mol	424592500
thiamine hydrochloride	Sigma, 337.27 g/mol	T1270-100G
L-tryptophan	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-phenylalanine	Sigma, 165.19 g/mol	P5482-100G
L-threonine	Sigma, 119.12 g/mol	T8625-100G
glycerol anhydrous	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
ethanol anhydrous	Gadot	830000054
razor blade	Eddison	NA
circular cellulose filter papers	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaraldehyde	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water	16220
paraformaldehyde	EMS, 16% in water	15710
sodium cacodylate	Merck, 214.05 g/mol	8.2067
calcium chloride 2-hydrate	Merck, 147.02 g/mol	1172113
stub-aluminium mount	EMS, sloted head	75230
carbon adhesive tape	EMS	77825-12
Shaker 37°C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuge	Eppendorf table top centrifuge 5424	NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip	Branson	NA
Incubator 30 °C	Binder	NA
Incubator 23 °C	Binder	NA
Filter System, 500 ml, polystyrene	Cornig Incorporated	NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
CPD 030 Critical Point Dryer	BAL-TEC	NA
Environmental Scanning Electron Microscope	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA