Abstract
Scramblases транслокации фосфолипидов поперек мембраны бислой двунаправленным в АТФ-независимым способом. Первый scramblase быть идентифицированы и проверены биохимически был Opsin, апопротеина фоторецептора родопсина. Родопсин является G-белком рецептор локализован в стержень фоторецепторов дисковые мембраны сетчатки, где он отвечает за восприятие света. Scramblase деятельность родопсина не зависит от его лиганда 11- цис - -retinal, т.е. апопротеинового опсина также активен как scramblase. Хотя конститутивный и регулируется фосфолипид скремблирования играют важную роль в клеточной физиологии, лишь несколько фосфолипидов scramblases были определены до сих пор, кроме опсином. Здесь мы опишем флуоресцентного анализа на основе из scramblase активности Opsin в. Opsin восстанавливали в большие однослойные липосомы, состоящие из фосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и следовые количества флуоресцентного НБД-меченых ПК (1-рalmitoyl-2- {6- [7-нитро-2-1,3-benzoxadiazole-4-ил) амино] гексаноил} - зп глицеро-3-фосфохолин). Scramblase активность определяют путем измерения степени, в которой молекулы НБД-PC, расположенные во внутреннем листке везикулы способны получить доступ к наружной листовку, где их флуоресценции химически устранен с помощью восстанавливающего агента, который не может пересекать мембрану. Методы, описанные нами находит широкое применение и могут быть использованы для идентификации и характеристики scramblase деятельности других мембранных белков.
Introduction
Фоторецепторов родопсин, прототипическим G-белком рецептор (рассмотрен, например , в ссылке 1), является первым фосфолипид scramblase быть идентифицированы и биохимически проверено 2,3. Scramblases являются фосфолипидов транспортеров , которые увеличивают внутренне медленную скорость transbilayer фосфолипидов движения физиологически соответствующих уровней в двунаправленной, АТФ-независимым способом 4-6. Примерами их действий могут быть найдены в эндоплазматический ретикулум и бактериальной цитоплазматической мембраны , где конститутивным скремблирования необходим для мембранного гомеостаза и роста, а также для различных путей гликозилирования 5. Регулируемый фосфолипид скремблирование необходимо подвергать фосфатидилсерина (PS) на поверхности апоптотических клеток , где он действует как "съесть-меня" -сигнала для макрофагов 7 и обеспечивает поверхность прокоагулянтную на активированных тромбоцитах , чтобы катализировать образование фактора белкаы необходимы для свертывания крови. В фоторецепторов дисковых мембран, карабкаясь активность родопсина была предложено , чтобы противодействовать фосфолипидов дисбаланс между двумя мембранами листков бислоя , который генерируется АТФ-зависимый, однонаправленного липида флиппазы abca4 4,8,9 10-12.
Несмотря на Физиологическое значение scramblases, их идентичность остаются неясными до родопсина не сообщалось как scramblase в фоторецепторных дисков 2, были идентифицированы членами семейства белков TMEM16 , как Са 2+ -зависимые scramblases , необходимые для облучения PS в плазматической мембране (обзор в ссылке 13), и бактериальный белок FtsW был предложен как липид II scramblase требуется для синтеза пептидогликана 14. Эти открытия были основаны на восстановлении очищенных белков в липосомы и демонстрации scramblase активности в результате протеолипосом с использованием методологии describред здесь. Другие потенциальные scramblases 15-21 - эти белки MurJ и Amj замешанные в пептидогликана биосинтеза, WzxE и родственные белки участвуют в скремблирования O-антиген предшественников, ФЗПНМ белков необходимо для транслоцироваться аминоацилирована фосфатидилглицерин через цитоплазматическую мембрану бактериальной, и члены семьи Xkr8 , которые были предложены выставить PS на поверхности апоптотических клеток - остаются для тестирования биохимически. Это подчеркивает важность надежного анализа, чтобы определить и охарактеризовать scramblase активность.
Здесь мы описываем воссоздание очищенного опсином, апопротеина фоторецептора родопсина, в большие однослойные везикулы (БУВ), и последующий анализ scramblase активности в результате протеолипосом с использованием флуоресцентного анализа на основе. Есть несколько хорошо описанных протоколов, доступных в литературе для гетерологичной экспрессии и очистки опсином, поэтому мы не будемописать его в этом протоколе; мы используем протоколов , описанных в Горен и др. 3 , который дает ФЛАГ-меченый, термостабильный опсина при температуре около 100 нг / мкл в 0,1% (вес / объем) dodecylmaltoside (ДДМ).
Разбавление достигается путем обработки БУВ с достаточным моющим средством таким образом, что они набухают, но не растворяются. В этих условиях, мембранный белок - поставляется в виде белково-детергентных мицелл - интегрирует в липосомы и стать восстанавливали в липосомальной мембраны при удалении моющего средства, в результате чего протеолипосомах. Для того, чтобы восстановить опсином (полученный в виде очищенного белка в 0,1% (вес / об) DDM), БУВ получают из смеси РОРС (1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин) и POPG (1- пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3- [фосфо-рац- (1-глицерин)]) и насыщали DDM перед добавлением опсином и NBD-PC. Моющее средство удаляют путем обработки образца с полистирольных шариков.
деваха = "jove_content"> Принцип , лежащий в основе флуоресцентного анализа на основе показана на рисунке 1В. БУВ симметрично разведен с помощью микроскопического количества NBD-PC или другого НБД-меченого флуоресцентной фосфолипидного репортера (Рис . 1А) При добавлении дитионита, мембраносвязанным impermeant дианион, молекулы НБД-ПК в наружном листке БУВ оказываются нефлуоресцирующего как нитро-группой NBD сводится к нефлуоресцентном амино-группы. Поскольку ни молекулы НБД-PC, ни дитионит способны проходить через мембрану, на временной шкале эксперимента (<10 мин), это приводит к уменьшению на 50 флуоресцентного сигнала%. Тем не менее, если липосомы разведен с помощью scramblase, молекулы НБД-ПК во внутреннем листке может быстро вскарабкаться к внешней стороне, где они уменьшаются. Это приводит к полной потере флуоресценции в идеальном случае (рис 1C).
эс / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Рисунок 1: Схематическое изображение анализа scramblase активности Анализ используется люминесцентная NBD-меченых репортер липида; НБД-ПК показан (А). Большие однослойные везикулы восстанавливали микроскопического количества NBD-PC. Разбавление производит симметричные везикул, с НБД-PC распределенной равномерно во внешних и внутренних листков. Дитионит (S 2 O 4 2-) химически уменьшает нитро-группу NBD к нефлуоресцентном амино-группы. Лечение безбелковых липосом с дитионита (B, вверху) приводит к снижению на 50% от флуоресценции , так как только молекулы НБД-ПК в наружной листовке снижаются: дитионит отрицательно заряженными и не могут пересекать мембрану , чтобы вступать в реакцию с молекулами НБД-PC во внутреннем листке. Дитионит лечение Opsin содержащих протеолипосом (B, внизу), т.е. scramblase-активных протеолипосомы, приводит к 100% потере еluorescence, как опсином облегчает перемещение НБД-PC между внутренним и наружным листком. (С) показывает идеализированные флуоресценции следы , полученные на лечении небелковых липосом и Opsin содержащих Протеолипосомы с дитионита. Скорость потери флуоресцентной одинакова в обоих случаях, указывающих, что химическое восстановление NBD дитионитом является ограничивающим скорость, и что скремблирования происходит со скоростью, равной или большей, чем скорость химической реакции. Следы , полученные от фактического эксперимента показаны на рисунке 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Методы , описанные нами могут быть использованы для восстановления и пробирного другие очищенные белки, а также их смеси мембранных белков , полученных, например, путем экстракции микросом с помощью моющих средств 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение липосом, и протеолипосомах
- липосом Формирование
- С помощью стеклянного шприца, добавьте 1,435 мкл POPC (25 мг / мл, в хлороформе) и 160 мкл POPG (25 мг / мл, в хлороформе), в круглодонную колбу, чтобы получить 52,5 мкмоль липидов в мольном соотношении РОРС: POPG = 9: 1.
- Сухие липиды в течение 30 мин с помощью роторного испарителя при скорости вращения 145 оборотов в минуту (без воды ванны не требуется для этого объема растворителя), а затем перенести колбу на вакуумном эксикаторе в течение по меньшей мере 3 ч или в течение ночи при комнатной температуре (RT).
- Увлажняют высушенную липидную пленку с 10 мл 50 мМ HEPES рН 7,4, 100 мМ NaCl (далее упоминаемый в качестве буфера А) путем осторожно взбалтывая колбу до получения однородной, мутная результаты подвески;
Примечание: Концентрация липида на данном этапе, как ожидается, будет 5,25 мМ, как без потерь не должно иметь место до сих пор. - Разрушать ультразвуком суспензию в водяной бане в течение 10 мин при комнатной температуре с частотой OF 40 кГц. Решение будет выглядеть несколько яснее.
- С помощью экструдера, Суспензию пропускали 10 раз через мембрану с размером пор 400 в нм, за которым следует второй цикл экструзии с 4 проходит через мембрану с размером пор 200 нм.
Примечание: Средний диаметр полученных БУВ составляет ~ 175 нм. При необходимости, размер и однородность БУВ можно проверить с помощью динамического рассеяния света в соответствии с инструкциями изготовителя. - Количественная фосфолипидов концентрацию LUV суспензии, как описано в разделе 1.2).
Примечание: Из-за потерь во время экструзии, концентрация, как правило, около 3,6 мМ. - Хранить БУВ при температуре 4 ° С в течение приблизительно 2 недель, если не использовать сразу.
- фосфолипидов Количественное
Примечание: Для определения фосфолипидной концентрации LUV суспензии, используемой для восстановления, а также, что из протеолипосомах, которые в конечном счете сгенерированных аликвоту образца Тематические ссылкиИДКТК окисления хлорной кислотой. Эта процедура разрушает фосфолипиды выпустить неорганического фосфата , который затем определяют количественно с помощью колориметрического анализа по сравнению со стандартами 23.- Готовят 40 мМ исходного раствора фосфата натрия (Na 2 HPO 4) в деионизованной дистиллированной воде.
- Развести маточного раствора деионизированной дистиллированной водой, чтобы получить 4 мМ и 0,4 мМ рабочие растворы, которые будут служить в качестве калибровочных стандартов.
- Использование рабочих растворов следует подготовить стандарты в 13 х 100 мм 2 стеклянные трубки в диапазоне от 0 до 80 нмоль фосфата натрия в конечном объеме 50 мкл.
- Взять по 10 мкл каждого из LUV и proteoliposome проб должны быть определены количественно и разбавляют 40 мкл DDH 2 O в 13 х 100 мм 2 стеклянные трубки.
Примечание: По мере того как концентрация липидов в БУВ и протеолипосомах находится в диапазоне 2,5-5 мкм, 10 мкл образца должен содержать 25-50 нмоль липидного фосфора. - Добавьте 300 мкл хлорной кислоты к каждому из стандартов и образцов и высокой температуре в течение 1 ч при 145 ° С в нагревательном блоке. Поместите шарики на трубы, чтобы предотвратить испарение.
- Пусть трубы охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1 мл DDH 2 O.
- Добавьте 400 мкл каждого из свежеприготовленного 12 г / л молибдата аммония и 50 г / л аскорбата натрия и вихревые перемешать.
- Тепло в течение 10 мин при 100 ° C с шариками в верхней части пробирки. Удалить труб из нагревательного блока и дайте им остыть до комнатной температуры.
- Измеряют поглощение образцов против заготовки (стандартного образца, содержащего 0 нмоль фосфата натрия) с помощью спектрометра при длине волны 797 нм.
- Определить содержание фосфатов образцов по отношению к стандартной кривой калибровки.
- Воссоздание Opsin
Примечание: Необходимо, чтобы определить оптимальные условия припухлость восстановления, поскольку они зависят от природы моющего средства, а такжев качестве липидной композиции и концентрации БУВ. Как БУВ изменяют свои свойства рассеяния света на отечность процесс можно контролировать путем измерения оптической плотности (рисунок 2), рассмотренный Риго и Леви 24 и Geertsma и др. 25.- Пипетка 800 мкл БУВ (из раздела 1.1; а восстановление липидного после экструзии составляет 70%, ожидаемая концентрация БУВ составляет 3,6 мМ фосфолипидов) в пробирке 2 мл.
- Добавить 5,3 мкл буфера А и 34,7 мкл 10% (вес / объем) ДДМ, растворенного в буфере А.
- Выдержите в течение 3 ч при комнатной температуре с конечным над уровнем конца перемешивания.
- В то же время подготовить полистирольные шарики:
- Используйте 400 мг шариков на образец и взвесить их в стеклянном стакане.
- Промыть их дважды с метанолом, три раза водой и один раз буфером A. Для каждого шага использования промывной 5 мл жидкости и медленно перемешивать в течение 10 мин.
Примечание: Рекомендуется подготовить полистиролшарики для нескольких образцов одновременно, например, весят в 6 г гранул и промывают 75 мл жидкости. Избыточные шарики можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней.
- В течение последних 30 мин везикул дестабилизацию просушить НБД-меченного фосфолипида в шнековом-колпачок стеклянной трубки ( 'восстановление стеклянная трубка'): на одну пробу, 9,5 мкл НБД-PC (1 мг / мл в хлороформе, получа 0,4 моль% от общего количества фосфолипидов) сушат под струей азота в стеклянной трубке, а затем растворяли в 45 мкл 0,1% (вес / об) DDM в буфере А.
- После 3 ч везикул дестабилизацию добавить растворенный-НБД-меченного фосфолипида РГМ-растворимый белок и буфер А так, чтобы конечный объем 1 мл содержит 0,36% (вес / объем), то есть, 7 мМ, ДДМ.
- Таким образом, чтобы генерировать небелковых липосом (используемые в качестве контрольного образца) добавляют 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 60 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А; для протеолипосом добавить, для экзаменаPLE, 40 мкл белка (от типичного исходного раствора ~ 110 нг / мкл) в 0,1% DDM, 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 20 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А ,
Примечание: Порядок добавления должны быть в списке.
- Таким образом, чтобы генерировать небелковых липосом (используемые в качестве контрольного образца) добавляют 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 60 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А; для протеолипосом добавить, для экзаменаPLE, 40 мкл белка (от типичного исходного раствора ~ 110 нг / мкл) в 0,1% DDM, 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 20 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А ,
- Перемешивают образец еще в течение конца ч в течение конца при комнатной температуре.
- Добавляют 80 мг приготовленных гранул полистирола и инкубирование образца с конечным над уровнем конца перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Затем добавить еще 160 мг гранул полистирола и инкубировать с концом поверх конца перемешивание еще в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Переносят образец (оставляя затраченные полистирольные шарики позади) к стеклянному с завинчивающейся крышкой пробирку, содержащую 160 мг свежего гранул полистирола и перемешать в течение ночи при температуре 4 ° С.
Примечание: Самый простой способ переноса образца и избежать поглощая бусинок использовать пипетку Пастера, который нажимается на нижней части стеклянной трубки с небольшим положительным давлением. После того, как кончик пипетки твердо нанижней части трубы, затем образец может быть легко снята без помех со стороны бортов. - На следующее утро, перенести образец в пробирке без переноса бусы и место на льду в рамках подготовки к пробе scramblase активности.
2. Scramblase Анализ активности
Примечание: Интенсивность флуоресценции липосом или протеолипосомах разбавлены буфером А контролируется с течением времени при добавлении дитионита в флуоресцентном спектрометре. Для получения стабильной начальную интенсивность флуоресценции регистрируется в течение по крайней мере 50 секунд (или до тех пор, стабильный сигнал не будет достигнуто) перед добавлением дитионита к образцу непрерывно перемешивают и затем следует по крайней мере, 500 сек после добавления дитионит.
- Добавьте 1950 мкл буфера А на пластиковую кювету, содержащую мини-бар перемешайте.
- Добавляют 50 мкл приготовленной Proteo (липосом), и пусть образец уравновешиваться в флуоресцентном спектрометр при постоянном перемешивании в течение нескольких секунд.
- В то же время приготовить раствор 1 М дитионита в 0,5 М небуферизованном Трис (например, для двух образцов отвешивают 20 мг дитионита в пробирке и растворяют в 114 мкл охлажденного на льду 0,5 М Трис непосредственно перед использованием и хранить на льду в течение следующего образец).
Примечание: дитионит раствор должен быть подготовлен свеже и не должно быть использовано более чем через 20 мин после приготовления; если много измерений должны быть сделаны, аликвоты дитионита могут быть взвешены заранее и растворяют непосредственно перед использованием. - Запустите мониторинг флуоресценции (возбуждение 470 нм, эмиссия 530 нм, ширина щели 0,5 нм).
- Добавьте 40 мкл 1 М раствора дитионита в кювету 50 сек после начала флуоресценцию съемки (с использованием перегородку в крышке камеры кювета если это возможно) и продолжают регистрировать флуоресценцию в течение еще 400-600 сек.
- Анализ данных, как описано в разделе 3.
3.Анализ данных
- Кинетика Scrambling
- Охарактеризуйте флуоресценции след каждого образца , полученного с помощью анализа scramblase активности путем определения начального флюоресценции, F I, перед добавлением дитионита, а конечная точка флюоресценции, F, достигается после того, как > 400 сек. F I определяется для каждого образца как среднее значение флуоресценции , за период 30 сек перед добавлением дитионита.
- Определить данные конечной точки , соответствующие степени восстановления флуоресценции, R = 100 • F / F я. Мы используем термины R L для безбелковых липосом и R P для Opsin содержащих протеолипосом.
- Определение молекулярной массой Функционально Scramblase восстановленного
- Преобразование данных по уменьшению флуоресценции в соответствии со следующим уравнением:
р (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R макс - R L) (уравнение 1)
ЗАМЕТКА: Где R макс является максимальное сокращение, которое получается , когда достаточное количество белка восстанавливали таким образом, что все пузырьки в образце обладают , по меньшей мере , одну функциональную scramblase, и р есть вероятность того, что конкретный везикул в реконструированном образце 'scramblase-активный », то есть он обладает , по меньшей мере , одной функциональной scramblase. Значение R L , как правило , 45% , тогда как 3 R Макс , как правило , 82,5% 3, вместо ожидаемого 100% (R макс может быть определено экспериментально для опсином протеолипосомах с ППР> 1 мг / ммоль). Как R макс <100% предполагается , что субпопуляции везикул является невосприимчивой к восстановления. Для R макс = 82,5%, доля везикул , что не может принять белок 0,35. - Опишите связь между р (≥1 scramblase) и ППР (мг белка / ммоль фосфолипидов) по статистике Пуассона следующим образом:
р (≥1 scramblase) = 1 - еПРИМЕЧАНИЕ: Если м = количество scramblases на пузырьке, а = моно-экспоненциальной подгонки постоянной в единицах мг белка / ммоль фосфолипидов. - Поскольку доля везикул не способствует карабкаться даже при высокой PPR (обсуждение см), изменить уравнение к:
р (≥1 scramblase) = 1 - ехр (-PPR * / α) (уравнение 3)
Примечание: Там , где ППР = ППР / (1- е), где F является огнеупорный популяция везикул или, в данном случае, ППР = ППР / 0,65 (Уравнение 4).
Примечание: Подгонка константа α определяется путем подгонки график р (≥1 scramblase) по сравнению с PPR * с моно-показательной функции. Если опсина (молекулярная масса 41,7 кДа) функционально реконструируют в пузырьках 175 нм диаметра (каждый пузырек имеет 280,000 фосфолипиды 26) в качестве мономера, а = 0,187 мг ммоль -1. Если опсина димеризуется до восстановления 3 с получением scramblase-активных везикул, то α= 0,37 мг ммоль -1. Если PPR PPR , а не * должны были быть использованы для анализа, то соответствующие значения альфа будет 0,122 и 0,244 мг ммоль -1. Эти предсказанные значения для а предположим, что все молекулы Opsin функционально компетентны. Если только часть молекул компетентен карабкаться липиды, то соответствующие значения а будет больше.
- Преобразование данных по уменьшению флуоресценции в соответствии со следующим уравнением:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описано воссоздание опсином в БУВ охарактеризовать его scramblase активности с использованием флуоресцентного анализа на основе. Анализируются результаты поместить нижний предел скорости опсина-опосредованной фосфолипида скремблирования и для определения олигомерного состояния, в котором опсина функционально реконструируют в везикулы.
Для определения оптимальных условий восстановление, необходимо определить эмпирически количество моющего средства, которое должно быть использовано для пополняют БУВ так, что они восприимчивы к вставке белка. Такой эксперимент показан на фигуре 2А. Аликвоты РОРС: POPG БУВ лечат с различными количествами РГМ в течение 3 ч, и поглощение образца измеряют при 540 нм, мера мутности и, следовательно, размер везикул. Оптическую плотность измеряли при 540 нм (OD 540) график показывает , что везикулы разбухает DDM Концвания увеличивается от 4-6 мм, достигнет точки насыщения на уровне около 7 мМ до начала растворять ( что соответствует потере мутности и OD 540 сигнала) , как DDM дополнительно увеличивается. НБД-ПК добавляется после обработки моющим средством, и образцы дополнительно инкубировали в течение одного часа перед обработкой гранул полистирола для удаления моющего средства. Распределение transbilayer из НБД-ПК определяется путем измерения потери флуоресценции после добавления дитионит к везикул (как описано выше). Таким образом, НБД-ПК вставляет в наружный листок везикул в отсутствие детергента, обозначенном его полной доступности к дитионит. Для получения везикул, обработанных> 2 мМ DDM, НБД-ПК способен распределить симметрично на обеих створок, так что, как только ДДМ удаляется 50% от НБД-компьютер защищен от дитионит.
На фиг.2В показан аналогичный дестабилизацию-восстановление эксперимента (перерисован из справки 2 </ SUP>), на этот раз отслеживать воссоздание опсином. В этом эксперименте, можно увидеть, что 7 мМ ДДМ необходим для опсина восстановления таким образом, что НБД-компьютер становится количественно (> 80%), которое доступно для дитионита в результате опсина-опосредованной скремблирования.
Рис . 2: Воссоздание НБД-PC и опсином в моющие-дестабилизировали везикул (А) Аликвоты везикулы обрабатывают диапазоном концентраций детергентов (0-9 мМ) путем смешивания конечного перепроизводство конец в течение 3 ч при комнатной температуре , В конце инкубационного периода измеряют оптическую плотность образцов при длине волны 540 нм (черная линия). НБД-ПК (растворенного в 0,1% вес / об DDM) затем добавляют и образец инкубировали в течение еще 1 ч при комнатной температуре до того, как моющее средство удаляют путем обработки гранул полистирола. Полученные липосомы анализируют с помощью Fluor Анализ снижения escent (красная линия), чтобы определить, в какой степени НБД-PC симметрично воссозданную. (В) , как в (A) , но в этом эксперименте везикулы , образованные из Яичные фосфолипиды (яичный PC / яичный фосфатидной кислоты, 9: 1 моль / моль) дестабилизируется с РГМ, и опсина был добавлен вместе с НБД-PC, в результате чего снижение флуоресценции около 80% после того , как белок эффективно восстанавливали и способен облегчить скремблирование НБД-PC (модифицированный из справки 2). Несмотря на то, НБД-ПК был симметрично восстановленная на 2 мМ DDM, идеальные условия для воссоздании опсином были выбраны вокруг пика OD 540 оптической плотности, то есть точки , где везикулы сильно опухшие из - за внедренного моющего средства , но еще не растворенной (обозначенный стрела). Для POPC / POPG (9: 1 моль / моль) везикулы, концентрации DDM 8 мм было установлено, что оптимальным для обоих НБД-PC и опсина восстановления./54635/54635fig2large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Степень снижения флуоресценции возрастает с количеством опсином , используемого для восстановления. На фиг.3А показана флуоресцентных следы , полученные при добавлении дитионита НБД-PC-содержащих небелковых липосом (черный след) и протеолипосомах восстанавливаемые опсину при различных белков в фосфолипидных соотношениях (PPR, в единицах мг белка на ммоль фосфолипидов, красные следы); следы были нормированы так , что все они имеют один и тот же начальный флуоресценции (F I) значение для облегчения визуализации. Моноэкспоненциален припадки следов указывают на очень похожие постоянные времени, начиная от 20-25 сек; поскольку скорость дитионит-опосредованное сокращение НБД-PC в безбелковых липосом является такой же, как в протеолипосомах, можно лишь поместить более низкую оценку на скорость опсина-опосредованной скремблирования (см текст для более подробной информации). Рисунок 3B показывает анализируемые данные , полученные из анализов по снижению флуоресценции с получением участков р (≥1) scramblase (вероятность везикулы , имеющей по меньшей мере один scramblase) по сравнению с экспериментально измеренной ППР (PPR , связанной с * как обсуждалось выше). Сравнение моноэкспоненциальный приступе экспериментальных результатов в гипотетических припадков, соответствующих опсином можно разводить в качестве мономера, димера или тетрамера, показывают, что опсина воссоздает функционально как димер.
Рис . 3: Scramblase активность опсином (А) Флуоресцентные следы , соответствующие дитионит лечение везикул воссозданных с НБД-PC и Opsin количествах в диапазоне от 0-4.95 мкг, обозначенное клина. Наименьшее количество опсином восстановленного соответствует PPR 0,21 мг / ммоль,второй по величине количество до 0,43 мг / ммоль и наибольшее количество до 1,3 мг / ммоль, или 10 опсинов в пузырьке в среднем. Дитионит был добавлен в указанное время (стрелка) и НБД флуоресценции контролировали в течение еще 400 секунд. Максимальная степень снижения флуоресценции видели в этом эксперименте составляла 85%, тогда как в среднем в течение многих экспериментов 82,5%. (В) белок зависимость скремблирования. Данные экспериментов, аналогичных панели А были проанализированы с использованием статистики Пуассона для генерации график вероятности везикул, имеющих по меньшей мере один scramblase (р ≥1 scramblase) в зависимости от белка к фосфолипид отношение (PPR) везикул (белок количественно пост- восстановление с помощью вестерн - блот анализа 3 и фосфолипид определяли путем измерения неорганического фосфата , выделяющейся при кислотного гидролиза). Красная линия представляет собой моно-показательная, пригодный для данных; штриховые серые линии представляют собой моно-экспоненциальная приспосабливает для воссоздания опсином в 170 нм диаметра Vesicles в качестве мономеров, предварительно сформированных димеров или предварительно сформированных тетрамеры. Поскольку ось х представляет экспериментально измеренная PPR (а не PPR * (см основной текст)), подходит константы соответствуют PPR , а не PPR * значения, как описано в основном тексте. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ scramblase активности позволил нам изначально определить , что опсина обладает фосфолипидов scramblase активностью 2. Анализ также позволил нам охарактеризовать scramblase активность Opsin путем тестирования специфичности (мы использовали различные НБД-меченых репортер липидов , таких как НБД-фосфатидилэтаноламина, меченные NBD на ацильной цепи , как показано на НБД-ПК на рисунке 1А, или на головная группа, НБД-сфингомиелина или NBD- фосфатидилсерин 2), эффект везикулы липидного состава (например, холестерин в разных количествах в качестве везикул составляющей), и является ли различных конформационных состояний опсином и родопсина все они демонстрируют scramblase активность. Эти анализы показали , что scramblase активность родопсина является очень быстро (> 10000 фосфолипиды в секунду), неспецифические для фосфолипидов и не зависит от конформационного состояния родопсина или действительно ли он содержит его хромофор сетчатки глаза 2,3. Вот,мы представили детальный метод для генерации Протеолипосомы, содержащих Opsin и показал, как для анализа этих препаратов для фосфолипидов scramblase активности.
Описанный протокол восстановление оптимизирован для данной композиции липидов и для воссоздании опсином после того, как он был очищен с помощью аффинной хроматографии с использованием в качестве солюбилизирующего DDM моющего средства. Состав липидной, а также моющее средство может быть изменено в соответствии с потребностями экспериментатора, хотя идеальные условия восстанавливающие для измененных условий должны быть определены путем выполнения "набуханием эксперимент" , описанный на рисунке 2. ДДМ эмпирически хорошо подходит для поддержания Opsin в стабильном и активном состоянии. Тем не менее, другие моющие средства, такие как октил-бета-глюкозид, CHAPS или Тритон Х-100 могут быть использованы следующие аналогичные протоколы. Triton X-100 является широко используемым моющее средство для воссоздании АТФ-связывающего кассетного транспортеров (ABC транспортерные) в качестве efficieNCY в опосредовании мембраны воссоздание выше , чем других моющих средств , и это также занимает меньше времени для уравновешивания с предварительно сформированными липосомами 24.
Можно определить олигомерный состояние функционально водостойких опсином если степень флуоресцентного редукции получена для образцов , восстановленных с различными количествами опсином, то есть в диапазоне от белка к фосфолипидных соотношений (ДОП). Для того чтобы сделать это, ППР восстановленным пузырьках должна быть явно измеряется как восстановление белка и фосфолипида может изменяться. Фосфолипиды восстановление может быть определено с помощью анализа фосфата, описанного в разделе 1.2, в то время как выход белка может быть оценена с помощью количественного анализа вестерн-блот, в котором очищенные протеины, используемые для reconstitutions используются для создания калибровочной кривой, что позволяет проводить сравнение с восстановлением разведенных образцов поперек диапазон PPR испытания (как описано подробно в ссылке 3).
Анализ scramblase активность основана на предположении, что дитионит не проникает в везикулы. Эта точка может быть проверена путем захвата растворимого NBD-меченых репортер в пузырьках и определения, может ли она быть уменьшена дитионита. Для этой цели, НБД-глюкоза (12,6 мкМ добавлены после того, как пузырек дестабилизацию) используется вместо НБД-PC. Этот водорастворимый молекула захватывается в протеолипосомах раз везикулы уплотнены и, следовательно, должны быть защищены от дитионит. Для того, чтобы НБД-глюкоза полностью доступным для восстановления, тритон Х-100 могут быть добавлены (1% вес / об) , который затем приводит к снижению 3,27 100%.
В протеолипосомы можно охарактеризовать, чтобы проверить, что восстановление как репортер липидов и белков является симметричным. Первое достигается столкновительными экспериментов закалочных с использованием ионов иодида в то время как последний основан на стратегии защиты протеазы с использованием AspN протеазы, которыеразрезает на конкретном участке вблизи С-конца опсином 3.
Переход от начальной флуоресценции (F I) , определенной в анализе scramblase активности до конечной точки флуоресценции (F) является сложной, но для наших целей он может быть разумно аппроксимировать одной экспоненциальной функцией распада. Постоянная времени, связанный с экспоненциальным спадом (20 сек), примерно одинакова для неактивных липосом и активных, опсином содержащих протеолипосомах, указывающими, что скремблирования происходит так быстро, или быстрее, чем скорость, с которой флуорофор НБД уменьшается на дитионит. Таким образом, анализ активности scramblase имеет плохое разрешение по времени (ограничение по химии дитионита сокращения), которая в настоящее время только допускает классификацию мутантов в активный, очень медленно или неактивным. Эта классификация может рассматриваться для кальция регулируется scramblase TMEM16 27: при высоких уровнях 2+ Ca, распад флуоресценции выявили постоянную времени , аналогичную тхат видели в безбелковых липосом, что указывает, что скорость лимитирующей стадией является химическое восстановление НБД-флуорофором дитионитом, чем липид скремблирования. Наоборот, при низком уровне Са 2+ не было достигнуто стационарное состояние флуоресцентного сокращения после 900 сек, что делает возможным различать два кинетических компонентов, присвоенной к уменьшению дитионита внешнего листка и более медленную к выдержке внутрипартийной листовку НБД-липидов на внешней стороне.
Расхождение между предсказанным потерей 100% флуоресценции на дитионита обработки везикул , полученных с высокой PPR (рис 1C) по сравнению с экспериментальной реальности , где трудно превысить ~ 85% скидки (Рисунок 3A) предполагает , что часть везикул является огнеупорный на восстановление. Эта фракция может соответствовать везикулы, что печать на ранней стадии процедуры восстанавливающего в качестве моющего средства адсорбируется на полистирольных шариков инет поэтому больше не в состоянии получить белок. Для анализа , описанного в разделе 3, мы предположили , что эта огнеупорная населения соответствует доле ф от общего количества везикул. Если предположить , что половина молекул НБД-PC (пул НБД-PC в наружной листовке) в тугоплавких везикул доступен для дитионита редукции, то мы оцениваем F = 2 • (1 - R макс / 100), или 0,35 при R макс = 82,5%.
Место р (≥1 scramblase) по сравнению с PPR * данные с моно-показательное уравнение обеспечивает пригонку константа а, из которого можно определить, является ли воссоздает опсина функционально в качестве мономера или димера, или смесь состояний, включая высшие мультимеры порядка , Интерпретация этих результатов усложняется, если доля молекул Opsin не может функционировать в скремблирования. Хотя это маловероятно, учитывая условия, при которых опсина очищают, которые гарантируют, что она сохраняет все ее белка Gдеятельность рецепторов, значение альфа, соответствующей функциональной вставки димеров также может быть истолковано в качестве функциональной вставки мономеров из препарата опсином где половина белки неактивны в качестве scramblases. Еще один момент, чтобы рассмотреть, что анализ, который мы представляем, что предполагает везикулы, используемые для восстановления являются однородными по размеру. В действительности, везикулы имеют диапазон диаметров, характеризующихся гауссовым распределением со стандартным отклонением соответствует приблизительно одной трети от среднего диаметра. К счастью, результаты анализа р (≥1 scramblase) по сравнению с PPR * Данные не оказывает существенного влияния на рассмотрение везикул неоднородностью и так простого анализа, что мы представили достаточно для описания данных.
Потенциальным ограничением методов, которые мы описали, что процедура работы ресурсоемких не позволяют измерять с высокой пропускной способностью очень высокого числа образцов Аой, что пузырек гетерогенность может нарушить отсчет. Первая проблема может быть преодолена с помощью формата Микротитровальный-пластины для анализа scramblase; вторая может быть решена в будущем единичных анализов везикул с использованием TIRF микроскопии.
Анализ дитионит для измерения scramblase активности можно рассматривать как очень надежный и прочный, как только процедуры дестабилизация и восстанавливающие установлены. Альтернативный подход для количественного определения трансмембранного переноса фосфолипидов, что также позволяет проверить результаты , полученные из анализа дитионит, является обратной экстракции короткоцепочечных НБД-липиды из внешнего листовке везикул с использованием не содержащего жирных кислот бычьего сывороточного альбумина 22. Обратной экстракции, а также тест с дитионит также применяют для характеристики и идентификации flippases из самых ATPases Р4 типа и ABC транспортеров 28-33.
По мере того как инструменты, представленные здесь, могут быть легко адаптированы в соответствии с differeнт потребности описанные процедуры являются универсальными и поможет в идентификации и характеристике фосфолипидов scramblases в будущем. Изучение идентичности многих из них, что из scramblase необходимого для расширения биогенных мембран в процессе роста клеток в том числе и имеет огромное физиологическое значение.
Для получения дополнительной информации и детального описания анализа данных, читатели могут обратиться к предыдущим публикациям из нашей лаборатории 2-4,27, а также другие 22,25,28,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
Dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
LIPEX 10 ml extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
2.0 ml Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
Zetasizer | Malvern | DLS |
References
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al.
Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011). - Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
- Ernst, O. P., Menon, A. K.
Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015). - Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
- Bevers, E. M., Williamson, P. L.
Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010). - Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
- Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
- Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
- Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
- Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
- Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
- Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
- Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
- Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
- Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
- Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
- Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
- Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
- Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
- Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
- Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
- Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
- Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
- Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
- Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
- Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
- Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
- Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
- Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).