Microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas
Summary
Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Abstract
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
Introduction
Contaminaciones ambientales, específicamente los de la gama de nanopartículas (NP) (1 – 20 nm de diámetro), se han relacionado con la obesidad y otras enfermedades neurodegenerativas debido a la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica 1-3. Una elevada exposición a la contaminación puede inducir inflamación en el sistema nervioso central, incluyendo el hipotálamo 1. Un mecanismo potencial en la que esto ocurre podría ser a través de nanopartículas inducida por la activación de la microglía (células inmunes del cerebro) 4. Estudios anteriores han utilizado en modelos in vivo para estudiar los efectos de los PN en la salud del cerebro, que consumen mucho tiempo, es caro, y no responder directamente a la pregunta de cómo influyen los PN microglia. La microglía jugar un papel de múltiples facetas en el sistema nervioso central, incluyendo el mantenimiento del microambiente del cerebro y la comunicación con neuronas circundantes a través de la liberación de factores secretados y citoquinas. Dependiendo de los estímulos, microglia se puede activar para un pr M1o-inflamatoria o un estado anti-inflamatoria M2. Por ejemplo, M1 activa microglia liberan citocinas pro-inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), mientras que M2 activa citocinas antiinflamatorias de liberación microglia incluyendo la interleucina-4 (IL-4). Para validar nuestro sustituto en biosensor vitro para determinar la neurotoxicidad de los contaminantes del aire, que mide la respuesta microglial a 20 nm (nanopartículas de plata AGNPS). El objetivo de este artículo es describir cómo una línea de células de la microglia in vitro puede ser utilizado como un marcador sustituto biosensor para probar la respuesta de la microglia murino de PN y cómo la activación microglial afecta a las células del hipotálamo. El largo plazo destinado aplicación de este modelo validado es poner a prueba los efectos de los contaminantes del mundo real sobre la salud del cerebro y las enfermedades neurodegenerativas. Proporcionamos una descripción detallada de un ensayo de formato in vitro de 96 pocillos para medir la activación microglial y la supervivencia celular hipotalámica siguiente a la exposición de mic roglial medios condicionados.
la activación microglial se determinó después de la exposición AgNP utilizando una enzima TNF-α ensayo inmunoenzimático (ELISA). Para determinar el efecto de la microglia activada en las células del hipotálamo, los AGNPS fueron retirados de sobrenadante microglial (medio acondicionado) usando un dispositivo de filtración. El dispositivo de filtración retiene las citoquinas, excluyendo los AGNPS en función del tamaño. Brevemente, se recogió el sobrenadante de microglia tratados con o sin AGNPS, se añadió a los filtros, y se centrifugó a 14.000 xg durante 15 min. Estábamos entonces capaz de determinar la influencia de las citocinas secretadas microgliales sobre la viabilidad celular hipotalámica. Se determinó la toxicidad de la célula después de la exposición a medio acondicionado (que contienen citoquinas) por medio de un ensayo basado en la resazurina como se describió previamente 5,6. Las células metabólicamente activas reducen la resazurina y producen una señal fluorescente proporcional al número de células viables 7.
nt "> Hay varias ventajas de la utilización de esta técnica sobre los demás (como co-cultivo, las configuraciones trans pocillos, o en experimentos in vivo). Nuestro modelo ofrece la posibilidad de activar directamente la microglía y determinar si los factores secretados son tóxicos para las neuronas 8 . El protocolo actual utiliza inmortalizado microglia BV2 estimulado con nanopartículas de 20 nm de diámetro, e inmortalizó células hipotalámicas murinos (designado mHypo-A1 / 2) 9 para la determinación de la respuesta posterior. Si bien este protocolo ha sido optimizado para estas condiciones específicas, los métodos puede ser modificadas para ser utilizadas en otros modelos de muerte celular microglial inducida, o con otros tipos de células incluyendo microglia primaria y las neuronas.Protocol
Representative Results
Discussion
Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Materials
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
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