Nanoparçacık Neurotoksite Belirleyen Bir Vekil Biosensor olarak mikroglia
Summary
Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Abstract
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
Introduction
Çevre kirliliği, özellikle nanopartikül (NP) aralığı olan (1-20 nm çapında), obezite ve kan-beyin bariyerinden 1-3 geçebilmekte bağlı başka nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. Kirliliğine yükseltilmiş maruz hipotalamus 1 de dahil olmak üzere, merkezi sinir sisteminde enflamasyonun neden olabilir. Bu mikroglia nanoparçacık kaynaklı aktivasyonu (beyin bağışıklık hücreleri) 4 kanalıyla olabilir meydana geldiği bir potansiyel mekanizma. Önceki çalışmalar zaman alıcı, pahalı beyin sağlığı üzerinde NPS etkilerini incelemek için in vivo modellerinde kullanmış ve doğrudan NPS mikroglia nasıl etkilediği sorusuna cevap yok. Mikroglia beyin mikro bakım dahil olmak üzere ve salgılanan faktörler ve sitokinlerin açığa ile nöronları çevreleyen iletişim merkezi sinir sisteminde, çok yönlü bir rol oynamaktadır. uyaranlara bağlı olarak, mikroglia bir M1 pr aktif hale getirilebiliro-inflamatuar veya M2 anti-inflamatuar durum. M2, interlökin-4 (IL-4) dahil olmak üzere, mikroglia salma anti-enflamatuar sitokinler aktive Örneğin, M1, mikroglia tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) gibi pro-enflamatuar sitokinleri serbest aktif. Hava kirleticilerin nörotoksik belirlenmesi için in vitro biyosensörle bizim vekil doğrulamak için, biz 20 nm gümüş nanopartikülleri (AGNPS) için mikroglial tepki ölçülür. Bu makalenin amacı bir in vitro mikroglial hücre hattı NP için fare mikroglial tepki test ve nasıl mikroglial aktivasyon hipotalamus hücrelerini etkiler için bir vekil biyosensör belirteci olarak nasıl kullanılabileceğini açıklamaktır. Uzun vadeli bu valide modelin uygulama, beyin sağlığı ve nörodejeneratif hastalık üzerinde gerçek dünya kirleticilerin etkilerini test etmek amaçlanmıştır. Bu mikrofon maruz kaldıktan sonra mikroglial aktivasyonu ve hipotalamik hücre yaşamını ölçmek için bir in vitro 96 oyuklu bir format ayrıntılı bir açıklama temin koşullu ortam roglial.
Mikroglia aktivasyonu testi (ELISA) bağlı immünosorban bir TNF-α enzim kullanılarak AgNP maruz kalındıktan sonra belirlendi. hipotalamik hücrelerde aktif mikroglia etkisini belirlemek için, AGNPS bir süzme cihazı kullanılarak mikroglial süpernatan (koşullu ortam) çıkarıldı. boyutuna göre AGNPS hariç ise filtrasyon cihazı sitokinler korur. Kısaca, AGNPS ile veya tedavi mikroglia alınan üst faz, toplanmış, filtrelere eklenmiş ve 15 dakika için 14,000 x g'de santrifüjlenmiştir. Daha sonra hipotalamik hücre canlılığı üzerine mikroglial salgılanan sitokinlerin etkisini belirlemek başardık. Daha önce tarif edildiği gibi 5,6 koşullu ortam (ihtiva eden sitokinler) maruz kaldıktan sonra hücre toksisitesi resazurin tabanlı tahlil ile belirlenmiştir. Metabolik olarak aktif hücrelerin resazurin azaltmak ve canlı hücreler 7 sayısı ile orantılı bir flüoresan sinyal üretir.
nt "> (örneğin, ya da in vivo deneyler ko-kültür, trans-kuyu kurulumları gibi) diğerleri üzerinde bu tekniği kullanarak birçok avantajı vardır. Bizim modeli doğrudan mikroglia etkinleştirmek ve salgılanan faktörler nöronlar 8 için toksik olup olmadığını belirlemek için yeteneği sağlar . geçerli protokol ölümsüzleştirilmiş BV2 mikroglia sıçangil hipotalamik hücreleri bu protokol bu spesifik koşullar için optimize edilmiş olsa da (belirlenmiş mHypo-A1 / 2) daha sonra karşılık belirlenmesi için 9., yöntemler olabilir 20 nm çapında nano ile uyarılmış ve ölümsüzleştirilmiş kullanır değiştirilmiş mikroglial kaynaklı hücre ölümünün diğer modellerde kullanılan veya birincil mikroglia ve nöronlar gibi diğer hücre tipleri ile edilmesi.Protocol
Representative Results
Discussion
Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Materials
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- . PubChem Compound Database Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004)
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
