fjernelse af<em> Drosophila</em> Muskel Væv fra larver Filet for Immunofluorescens analyse af sensoriske neuroner og epidermale celler
Summary
Undersøgelser af neuronal morfogenese hjælp Drosophila larvestadiet dendritiske arborization (da) neuroner gavn af in situ visualisering af neuronale og epidermale proteiner ved immunofluorescens. Vi beskriver en fremgangsmåde, der forbedrer immunofluorescensanalyse af DA-neuroner og omgivende epidermisceller ved fjernelse muskelvæv fra larve kropsvæggen.
Abstract
Drosophila larver dendritiske arborization (da) neuroner er en populær model til undersøgelse mekanismer neuronal morfogenese. DA neuroner udvikle sig i forbindelse med de epidermale celler, de innerverer og dermed deres analyse fordele fra in situ visualisering af både neuronalt og epidermalt udtrykte proteiner ved immunfluorescens. Traditionelle metoder til fremstilling af larver fileter til immunofluorescens eksperimenter forlade intakt muskelvæv, der dækker det meste af kroppen væggen, præsentere en række udfordringer til billeddannelse neuronale og epidermale proteiner. Her beskriver vi en fremgangsmåde til fjernelse muskelvæv fra Drosophila larvernes fileter. Denne protokol muliggør billeddannelse af proteiner, som ellers skjules af muskelvæv, forbedrer signal-støj-forhold, og letter brugen af super-opløsning mikroskopi for at studere da neuron udvikling.
Introduction
Drosophila larval dendritiske arborization (DA) neuroner udgør en værdifuld model til undersøgelse neuronal udvikling på grund af deres modtagelighed for genetisk manipulation og den lethed, hvormed de kan afbildes. Disse sensoriske neuroner har været medvirkende til at identificere mange veje, der styrer dendritceller morfogenese 1-3.
Fire klasser af DA-neuroner (klasse I – IV) innerverer larvestadium epidermis. Disse neuroner ligger mellem basalmembranen og epidermis, med deres dendritter danner stort set todimensionale arrays 4,5. Af de fire klasser, klasse IV da neuroner har de højest forgrenede dorne og ligesom sensoriske neuroner af andre dyr, udarbejdelsen af disse dorne kræver iboende faktorer samt stikord fra omkringliggende væv, især epidermis, for deres udvikling 6-9 .
Undersøgelser til at bestemme, hvordan en sådan neuronal og ekstra neuronal kendsgerningors styre dendritceller morfogenese fordel af evnen til at detektere proteinekspression in situ ved immunofluorescens. Den ydre neglebånd af larve er uigennemtrængelig for antistoffer, men denne hindring er let overvindes ved udarbejdelsen af larver fileter gennem veletablerede dissektion metoder 10,11. Imidlertid kropsvæggen muskelvæv, der ligger lige indre til basalmembranen giver adskillige udfordringer hen imod visualisering af DA-neuroner og epidermisceller. Først, muskelvæv, hvilke linjer fleste af kroppens væg, i høj grad tilslører fluorescerende signaler stammer fra neuronal eller epidermalt væv. Dette reducerer væsentligt signal-støj-forhold i prøven. For det andet kan mange relevante proteiner udtrykkes i muskelvævet samt i neuroner eller epidermis. Denne muskel-afledte fluorescenssignal vil sandsynligvis yderligere obskure detektion af et fluorescenssignal fra neuron eller epidermis. Endelig fremskridt i mikroskopi teknologier ikkew tilladelse billeddannelse af prøver ved sub-diffraktion opløsning og kan være særligt nyttigt i kræsne lokalisering af proteiner, der er udtrykt i neuroner og omkringliggende epidermale celler 12,13. Men billedbehandling via super opløsning mikroskopi fordele fra et stærkt signal til støjforhold og nærhed af prøven til dækglasset. Ud over at reducere signalet til støjforholdet, larve organ væg muscle afstande DA-neuroner fra dækglasset og dermed begrænse den forbedrede billedopløsning, der kan opnås med super opløsning mikroskopimetoder. Udover udfordringer for immunfluorescens analyse, muskelvæv præsenterer en barriere for elektrofysiologiske optagelse fra sensoriske neuroner i larvestadiet kroppen væggen. Dens fjernelse derfor gavner neurofysiologisk manipulation af sensoriske neuroner 14.
Her beskrives en fremgangsmåde til manuel fjernelse af Drosophila larvestadiet muskelvæv. Vi viser, at vores protokol permits immunfluorescens billeddannelse af proteiner, som ellers skjules af muskelvæv, forbedrer signal-støj-forhold for visualisering af klasse IV DA-neuroner, og muliggør anvendelse af super-opløsning mikroskopi til bedre skelne rumlige forhold af proteiner og cellulære strukturer i DA neuroner og epidermis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her en protokol er beskrevet for manuel fjernelse af muskelvæv fra Drosophila larver fileter. Denne protokol ændrer tidligere beskrevet larver dissektion teknikker 10,11. Efter larve dissekeres i en silikoneelastomer fad, er den dorsale midtlinje placeret. En enkelt pincet krog i sin fladeste mulig orientering, er omhyggeligt indsat mellem muskelvæv og epidermis, nær den dorsale midtlinje. Tangen er forsigtigt trækkes opad til separat muskelvæv fra et forankringspunkt i hvert larve segment af i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Gary Laevsky for nyttige diskussioner om mikroskopi. Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud R01GM061107 og R01GM067758 til ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
