Summary
Studien der neuronalen Morphogenese unter Verwendung von Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen profitieren von in - situ - Visualisierung von neuronalen und epidermalen Proteine durch Immun. Wir beschreiben ein Verfahren, das durch Entfernen von Muskelgewebe aus der Larvenkörperwand Immunfluoreszenzanalyse von da Neuronen und die umliegenden Hautzellen verbessert.
Abstract
Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen sind ein beliebtes Modell für Mechanismen der neuronalen Morphogenese zu untersuchen. Da Neuronen entwickeln in Kommunikation mit den Epidermiszellen sie innervieren und so ihre Analyse Nutzen aus in situ Visualisierung beider neuronal und epidermal exprimierten Proteine durch Immunofluoreszenz. Traditionelle Methoden der Larven Filets für Immunofluoreszenz Experimente vorbereiten lassen das Muskelgewebe intakt, dass die meisten der Körperwand erstreckt, mehrere Herausforderungen zu meistern neuronalen und epidermalen Proteine Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets entfernen. Dieses Protokoll ermöglicht die Abbildung von Proteinen, die ansonsten durch Muskelgewebe verdeckt sind, verbessert die Signal-Rausch-Verhältnis, und erleichtert die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie DA-Neuronenentwicklung zu untersuchen.
Introduction
Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen bieten ein wertvolles Modell für die neuronale Entwicklung des Studiums aufgrund ihrer Zugänglichkeit für genetische Manipulation und die Leichtigkeit , mit der sie abgebildet werden kann. Diese sensorischen Neuronen wurden bei der Identifikation zahlreicher Wege instrumental die Dendriten Morphogenese 1-3 steuern.
Vier Klassen von da Neuronen (Klasse I - IV) innervate die Larven Epidermis. Diese Neuronen liegen zwischen der Basalmembran der Epidermis und mit ihren Dendriten bilden weitgehend zweidimensionale Arrays 4,5. Von den vier Klassen, Klasse IV da Neuronen sich die hochverzweigten Lauben haben und, wie sensorische Neuronen von anderen Tieren, erfordert die Ausarbeitung dieser Dorne intrinsischen Faktoren sowie Hinweise aus benachbarten Geweben, insbesondere die Epidermis, für ihre Entwicklung 6-9 .
Studien, um festzustellen, wie solche neuronale und extra neuronale Tatsacheors steuern Dendriten Morphogenese Nutzen aus der Fähigkeit , die Proteinexpression in situ durch Immunfluoreszenz nachzuweisen. Die äußere Kutikula der Larve ist undurchdringlich für Antikörper, aber dieses Hindernis wird durch die Herstellung von Larven Filets durch gut etablierte Dissektion Methoden 10,11 leicht zu überwinden. Allerdings stellt die Körperwand Muskelgewebe, die gerade Inneren der Basalmembran liegt einige Herausforderungen zu Visualisierung von da Neuronen und epidermalen Zellen. Erstens, das Muskelgewebe, welche Linien die meisten der Körperwand, verschleiert stark fluoreszierende Signale von neuronalen oder epidermale Gewebe ausgeht. Dies reduziert erheblich das Signal-Rausch-Verhältnis in der Probe. Zweitens sind viele relevante Proteine werden in das Muskelgewebe sowie in den Neuronen oder Epidermis exprimiert wird. Dieser Muskel abstammenden Fluoreszenzsignal wird weiter zu verdunkeln Erfassung eines Fluoreszenzsignals von dem Neuron oder Epidermis wahrscheinlich. Schließlich Fortschritte in der Mikroskopie-Technologien keinew Genehmigung Bildgebung von Proben , die bei Unterbeugungs Auflösung und kann besonders hilfreich bei der Lokalisierung von Proteinen anspruchsvolle , die in Neuronen und die umliegenden Zellen der Epidermis 12,13 exprimiert werden. Allerdings Bildgebung mittels superauflösende Mikroskopie profitiert von einem starken Signal-Rausch-Verhältnis und die Nähe der Probe auf dem Deckglas. Zusätzlich zu dem Signal-Rausch-Verhältnis zu reduzieren, die Larvenkörperwand Muskel Abstände da Neuronen aus dem Deckglas, wodurch die verbesserte Bildauflösung zu begrenzen, die mit Superauflösungsmikroskopieverfahren erreicht werden kann. Neben Herausforderungen für die Immunfluoreszenzanalyse, stellt das Muskelgewebe eine Barriere für die Aufnahme elektro von sensorischen Neuronen im Larvenkörperwand. Seine Entfernung profitiert daher neurophysiologischen Manipulation von sensorischen Neuronen 14.
Hier ist ein Verfahren zur manuellen Entfernung von Drosophila Larve Muskelgewebe beschrieben. Wir zeigen, dass unser Protokoll permits Immunofluoreszenz Bildgebung von Proteinen, die sonst durch Muskelgewebe verdeckt, verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis für die Visualisierung der Klasse IV da Neuronen und ermöglicht die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie zur besseren räumlichen Beziehungen von Proteinen und Zellstrukturen in da Neuronen unterscheiden und die Epidermis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Das Verfahren für die Muskelentfernung (Abbildung 1) ist eine Modifikation der zuvor beschriebenen Verfahren für die Larven Filets vor. Die Schritte , die Muskelentfernung vorangehen und folgen , werden kurz skizziert und der Leser wird auf die bisherige Arbeit 10 bezeichnet, 11 für detailliertere Beschreibungen.
1. Dissect Larve in Cold Saline
- Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung von kaltem HL3.1 Salz 15 oder kalt Ca 2+ -freien HL3.1 saline 11 (Tabelle 1). Legen Sie die Larve in einem Silikon-Elastomer-Schale mit gerade genug kaltem Salz den Boden der Schale zu bedecken.
HINWEIS: Siehe Diskussion in Bezug auf die Wahl der Kochsalzlösung.
| 1x HL3.1 Kochsalzlösung (pH 7,2) |
| 5 mM HEPES |
| 70 mM NaCl |
| 1,5 mM CaCl 2 (weglassen für Ca 2+ -freien Salzlösung) |
| 4 mM MgCl 2 |
| 10 mM NaHCO 3 |
| 5 mM Trehalose |
| 115 mM Sucrose |
| Filter zu sterilisieren und lagern bei 4 ° C |
| Hinweis: Zusammensetzung ahmt Insekten Hämolymphe |
Tabelle 1. Zusammensetzung des Kalten Saline.
- Positionieren Sie die Larve mit der Bauchseite nach oben. Die ventrale Oberfläche der Larven durch die Bauch Dentical Riemen und der Rückenseite durch die primären Larven Trachealtuben von anterior nach posterior verlauf identifiziert werden. Dehnen Sie die Larve in der anterior-posterioren Richtung und stecken den Kopf und den Schwanz einSiliconelastomerschale mit Insektenstifte sezieren. Verwenden Sie feine Präparierscheren entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden, die an einem Ende beginnen und Fortschritte in Richtung auf die andere.
HINWEIS: Diese Ausrichtung bewahrt die häufigsten studierte dorsalen Cluster von da Neuronen. - Nachdem die Larve aufgeschnitten wird, an die Sezieren Gericht die vier Ecken stecken, als ob ein Buch zu öffnen. Verwenden einer Pinzette zu greifen und entfernen Sie die inneren Organe einschließlich des ZNS, Darm und Luftröhre. Stellen Sie Insektenstifte, so dass das Filet ist straff, aber nicht maximal gestreckt.
HINWEIS: Die Muskeln werden auf Segmentgrenzen an der Körperwand verankert. Obwohl Muskeln die meisten der Körperwand bedecken, sind sie in einem engen Bereich in der Nähe der Rückenmittellinie fehlt.
2. Muskelentfernung
- Suchen Sie die Rückenmittellinie der Larve, wo Muskelgewebe fehlt. Positionieren Sie eine einzelne Zange Zinke so dass es unter dem Muskelgewebe in der flachste mögliche Ausrichtung eingefügt werden.
- Beginnt umder Rückenmittellinie in der Nähe der vorderen Begrenzung des Segments gleitet vorsichtig die Zange Zinke zwischen dem Muskel und der Epidermis, wobei darauf geachtet Kontakt zwischen der Zange und der Epidermis zu minimieren.
- Ziehen Sie die Zange nach oben die Befestigung des Muskels an der Körperwand an einem Ankerpunkt zu brechen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Hemi-Segment (e) von Interesse.
HINWEIS: Dieses Protokoll Erhaltung des hinteren jedes da Neuron Dendriten Bereich optimiert. Um den vorderen Teil des Dendriten Feld zu erhalten, ist es am besten, die Zange Zinke am hinteren Ende jedes Segments einzufügen. - Nachjustieren Insektenstifte, so dass die Larven Filet maximal in alle Richtungen gedehnt wird.
- Befestigen Sie das Filet, während es noch auf dem Sezieren Schüssel mit kaltem, frisch zubereiteten 4% Formaldehyd in PBS für 25 min fixiert ist.
- Spülen Sie 5-mal in PBS.
- Verwenden einer Pinzette vorsichtig Muskelgewebe von den übrigen Ankerpunkte ziehen weg, wobei darauf geachtet Conta zu minimierenct mit der Epidermis.
- Loslösen und entfernen Sie das Filet vom Sezieren Schale in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie alle nachfolgenden Waschen, Sperrung und Immunfluoreszenzanfärbung Schritte, wie zuvor 11 beschrieben.
3. Montieren Sie den Larval Fillet
- Entfernen Sie zuerst den Kopf und Schwanz mit feinen Präparierschere, um die Probe so flach wie möglich zu machen. Montieren Sie das Filet auf einem Deckglas in Antifade mountant mit der inneren Oberfläche des Filets das Deckglas gegenüber.
- Platzieren Sie einen Objektträger auf dem Deckglas und drücken Sie vorsichtig die Montage Medium zu dispergieren. Klappen Sie den Mikroskop-Objektträger über und versiegeln Sie das Deckglas auf dem Objektträger mit Nagellack. Objektträger für mindestens einen Monat bei -20 ° C gelagert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir zeigen den Nutzen des Muskels Entfernungsprozedur für das Signal-Rausch-Verhältnis in Immunofluoreszenz Experimente Verbesserung der septate Junction-Proteine Coracle (Cora) und Disketten-large (DLG) zusammen mit der Klasse IV da Neuronen mit der Membran Marker markiert zusammen visualisieren CD4- tdTomato.
Cora wurde bisher verwendeten Flächen zu identifizieren , wo DA Neuron Dendriten von epidermalen Zellen eingeschlossen sind , und ist eine von vielen identifiziert epidermalen Faktoren , die im Zusammenhang mit der Morphogenese und Funktion von da Neuron Dendriten 4,6-9,16 untersucht wurden. Immunfärbung mit Anti-DsRed die Neuronen (rot) und Anti-Cora-Antikörper (grün) wurde auf Larvenfilets zu detektieren durchgeführt mit Muskel entfernt (Muskel-off) und mit Muskel intakt (Muskel-on). Für jede Bedingung wurde der hintere Dendriten Feld der da Neuron Klasse IV abgebildet, um eine Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop. Die Bilder wurden mit id erhaltenentical Abbildungsparameter für beide Bedingungen. Wir zusätzlich Muskel-Filets abgebildet mit erhöhten Laserleistung für Störungen aus dem Muskelgewebe zu kompensieren.
In Muskel-off Proben konnte Cora deutlich an epidermalen Zellgrenzen erfasst werden, im intermittierenden Flächen entlang der Klasse IV Dendriten da Neuron, und umreißt die Klasse IV da Neuron soma (Abbildung 2C). Im Gegensatz dazu wurde seine Lokalisierung zu diesen Domänen weitgehend in Muskel-on verdeckt Proben, auch wenn der Laserleistung (2A-2B) erhöht wurde. In Muskel-on Proben wurde Cora hauptsächlich in Muskeln visualisiert, Trachea und an der neuromuskulären Synapse (NMJ), die von der Körperwand als Folge der Muskelentfernungsprozedur getrennt werden. Das Fluoreszenzsignal von diesen Geweben ausgeh verdeckt die meisten der Cora, die Zellgrenzen zu epidermalen lokalisiert und Bahnen zu Dendrit, außer in dem schmalen Streifen des Körpers wall in der Nähe der Rückenmittellinie, wo Muskel fehlt. Cora, die die Klasse IV da Neuron soma skizziert wurde in Muskel-on - Proben (2A-2B) nicht sichtbar gemacht . Visualisierung von epidermal exprimierten Proteine, die auch eine hohe Muskel Ausdruck, wie Dlg haben, ist besonders problematisch. In Muskel-on Proben wurde die Verteilung von Dlg in der Epidermis fast vollständig durch Fluoreszenz aus dem Muskel und NMJ (2D) verdeckt. Nach dem Muskelabbau, wird Dlg leicht an epidermalen Zellgrenzen erfasst, in intermittierenden Bahnen entlang da Neuron Dendriten, und umreißt die Klasse IV da Neuron soma (Abbildung 2E). Somit ermöglicht Muskelentfernung Visualisierung von epidermal und neuronal exprimierten Proteine sonst durch Muskel verdeckt und dazugehörigen Gewebe.
Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität des da Neuron Marker Klasse IV reduziert erschien Muskel-Filetsim Vergleich zu Muskel-off Filets bei der Abbildung Parameter konstant zwischen den beiden Probenvorbereitungen (2A, 2C) gehalten wurden. Mit zunehmender Laserleistung, die scheinbare Fluoreszenzintensität der da Neuron Marker Klasse IV könnte Muskel-off Proben angepasst werden, wurde aber Hintergrundrauschen erhöht (2B, 2C). Daher verbessert die Muskelentfernung das Signal-Rausch-Verhältnis in unseren Proben.
Schließlich testeten wir, ob die durch das Entfernen Muskelgewebe gewonnen Verbesserungen Bildgebungs der Klasse IV da Neuronen bei unteratmosphärischem Beugungsauflösung angewandt werden könnte. Dazu wurde 3D - strukturierten Beleuchtung Mikroskopie (SIM) Bildgebung durchgeführt, die 13 etwa 120 nm laterale Auflösung erzielt. Wie bei der konfokalen Bildgebung, verglichen wir Muskel-on und Muskel-off Filets für Cora und Klasse IV da Neuronen immunhistochemisch, zunächst unter identischen Bedingungen Bildgebung und dann Laserleistung nach der Optimierung, Exposure Zeit und Bildverarbeitung für muskel an Proben. Ähnlich wie bei der konfokalen Mikroskopie, eine im Wesentlichen reduzierte Signal - Rausch - Verhältnis im Muskel-on wurde als Muskel-off Filets (3A-3C) im Vergleich beobachtet. Darüber hinaus erschien der Bildrekonstruktion schärfer in Muskel-off-Proben. Im Vergleich zu muskel an Proben wurden weniger offensichtlich Artefakte beobachtet und Cora Dendriten Bahnen wurden leichter aufgelöst (3B, 3C). Dendrite Membranen könnte bei etwa 114 nm in der Breite in Muskel-off Filets gemessen werden , sondern erschien 272 nm breit in Muskel-Filets (3D, 3E) zu sein. So ermöglicht unser Protokoll die Anwendung der Super-Resolution-Mikroskopie zur Visualisierung von da Neuronen Klasse IV.
Abbildung 1. Überblick über die Muskelausbauverfahren. Eine Larve wird seziert und zu einem Silikon - AbonnentenElastomer Sezieren Gericht. Zum Muskelgewebe, einer Zange Zinke zwischen dem Muskel und epidermale Zellschicht eingefügt ist, ausgehend von der dorsalen Mittellinie in der Nähe einer Segmentgrenze (2.2) zu entfernen. Die Zange nach oben gezogen, die Befestigung zwischen dem Muskel und Körperwand (2.3) zu brechen. Dies ist für die interessierende Segmente wiederholt, und dann wird die Larve in Formaldehyd fixiert (2.5). Nach der Fixierung werden Pinzette verwendet, um die verbleibenden Muskelgewebe aus der Körperwand zu trennen (2,7-2,8) Die Larvencuticula und Epidermis sind in orange, Klasse IV da Neuronen in Grün und Muskeln in rot dargestellt. Die Einschübe in (2.2) und (2.7) stellen Querschnittsansichten eines einzelnen Larven Hemi-Segment. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. MuskelentfernungVerbessert die konfokale Abbildung von da Neuronen und der Epidermis Immunofluoreszenz von Cora. (Grün; AC) oder Dlg (grün; DE) wurde mit Muskelgewebe (A, B, D) erkannt und ohne Muskelgewebe (C, E). Klasse IV da Neuronen wurden unter Verwendung des 477 - Treiber 'GAL4 UAS markierten CD4-auszudrücken: tdTomato und nachgewiesen mit einem anti-dsRed Antikörper (rot). Muscle-on und Muskel-off Proben für Cora markiert wurden zuerst mit einem konfokalen Mikroskop unter identischen Bedingungen (A, C) und dann mit einer erhöhten Laserleistung für die Muskelstörung (B) zu kompensieren abgebildet. Muscle-on und Muskel-off Proben für Dlg markiert wurden unter individuell optimierten Bedingungen abgebildet. Alle Bilder sind konfokalen Z-Projektionen. Die mittlere (grün) und Boden (rot) Tafeln zeigen einzelne Kanäle; die oberen Platten sind die fusionierten Kanäle. Die Grenze des Muskelgewebes (gestrichelte Linien), die Klasse IVda neuron soma (cyan Pfeile), Cora und Dlg Dendriten Flächen (weiße Pfeile), epidermaler Zellgrenzen (magenta Pfeile), NMJ (gelbe Pfeile) und der Trachea (orange Pfeile) sind angegeben. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Muscle Entfernen Ermöglicht Superauflösung von Imaging von da Neuronen und epidermalen Zellen. Immunfluoreszenz - Nachweis von Cora (grün) in der Klasse IV da Neuronen mit Muskel intakt (A, B) und nach Muskelentfernung (C). Klasse IV da Neuronen wurden , wie in Figur 2 markierten Muscle-on und Muskel-off - Proben wurden mit einem strukturierten Beleuchtungsmikroskop abgebildet ersten unter identischen Bedingungen (A, C). der Muskel-on Probein (A) wurde dann mit einer erhöhten Laserleistung und Belichtungszeiten für die Muskelstörung (B) zu kompensieren , wieder abgebildet. Alle Bilder sind Z-Projektionen. Die mittleren (grün) und Boden (rot) Platten von AC zeigen einzelne Kanäle. Die obere Platte von AC ist eine Zusammenführung. Epidermalen Zellgrenzen (magenta Pfeile), Cora Dendriten Flächen (weiße Pfeile) und eine Bildrekonstruktionsartefakten (gelbe Pfeilspitze) sind angegeben. Einfügungen in den Bodenplatten von B und C entsprechen, D und E bezeichnet. Die scheinbare Breite der Dendriten Membran wird in Muskel-on (D) und Muskel-off (E) Proben gezeigt. Maßstabsbalken = 3 & mgr; m (AC) und 0,5 & mgr; m (D, E). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier ist ein Protokoll für die manuelle Entfernung von Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets beschrieben. Dieses Protokoll modifiziert vorher Larven- Dissektion Techniken beschrieben 10,11. Nachdem die Larven in einer Silikonelastomerschale zergliedert wird, wird der dorsalen Mittellinie befindet. Eine einzelne Zange Zinke, in seiner flachsten mögliche Ausrichtung, ist zwischen dem Muskelgewebe und der Epidermis, in der Nähe der Rückenmittellinie sorgfältig eingeführt. Die Zange gezogen sanft nach oben zu trennen Muskelgewebe von einem Ankerpunkt in jedem Larven Segment von Interesse. Die Larven Filet wird dann in kaltem Formaldehyd fixiert, nach der Zange verwendet werden, wieder Muskel von den übrigen Ankerpunkte wegzuziehen.
Während es ist verlockend, die Gesamtheit der Muskelentfernung Verfahren nach der Fixierung durchzuführen, so finden wir, dass gedehnten Muskels, einmal fixiert, abgeflachte bleibt und in engem Zusammenhang mit der Epidermis auch nach der Ablösung von einem Ankerpunkt angelagert, Renderinges schwierig, ohne Beschädigung des darunter liegenden Gewebes zu manipulieren. Außerdem in unserer Erfahrung, feste Muskelgewebe ist spröde und reißt leicht, seine vollständige Entfernung aus der Körperwand zu verhindern. Im Gegensatz dazu, wenn Muskel von einem Ankerpunkt Fixierung vor gelöst ist, wird es in Richtung des verbleibenden Ankerpunkt während der Fixierung kontrahieren, Gewebe stubs verlassen, die durch die Zange leichter ergriffen werden kann und von der larvalen Körperwand gezogen.
Um Proben am besten erhalten, müssen erhebliche Sorgfalt Kontakt zwischen der Zange ein Mindestmaß zu beschränken und die Epidermis während der Muskelentfernung Verfahren. Als Ergebnis kann unser Protokoll mehrere Minuten vorher beschriebenen Techniken dissection 10,11 hinzuzufügen. Zu Gewebeabbau, die Zahl der Larven zu vermeiden, die vor der Fixierung zergliedert werden sollte so begrenzt werden, dass die verstrichene Zeit nicht mehr als 25 Minuten. Darüber hinaus wird empfohlen, testen wir mehrere Paare von Zangen - Zangen des gleichen model erheblich in Form und Schärfe variieren - und das Einstellen der Umfang, in dem Filets werden vor der Muskelentfernung gestreckt, um Gewebeerhaltung und Dissektion Geschwindigkeit zu verbessern.
Schließlich empfehlen wir das Experimentieren mit der Verwendung von Ca 2+ -freien HL3.1 Saline im Vergleich zu Standard HL3.1 Saline während Larven Dissektion. In Abwesenheit von Calcium, werden larvale Muskelkontraktionen stark reduziert. So kann Larven Filets leichter sein , wenn in Ca 2+ -freien HL3.1 Salz seziert zu manipulieren. Allerdings finden wir, dass die Muskelkontraktion Raum zwischen dem Muskel und der Epidermis erzeugt, und dies kann das Einführen der Zange zwischen diesen Geweben zu erleichtern und gleichzeitig das Risiko einer Beschädigung der Epidermis minimieren. Als Ergebnis können Standard HL3.1 für die Erhaltung der Integrität der Epidermis und da Neuronen vorzuziehen. Wir erhalten gute Ergebnisse mit entweder Kochsalzlösung und die Wahl dem Benutzer überlassen wird.
Während unser Protokoll erhöhtdie Dauer und die Komplexität der zuvor beschriebenen Techniken Dissektion 10,11, bietet es eine Reihe von Verbesserungen , die für die Abbildung Larven sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen nützlich sind. Erstens erlaubt es Bildgebung von neuronal und epidermal exprimierten Proteine, die durch das Muskelgewebe sonst verdeckt sind. Zweitens verbessert das Fluoreszenzsignal-Rausch-Verhältnis. Schließlich ermöglicht es die Verwendung von Super-Resolution-Mikroskopie für hervorragende Diskriminierung von Protein räumlichen Beziehungen in DA Neuronen und der Epidermis. Die verbesserte Bildqualität, die wir folgende Muskel Entfernung beobachten, ist wahrscheinlich das Ergebnis der reduzierten Photonen-Absorption und Streuung sowie reduzierte Abstand zwischen der Probe und dem Deckglas. Obwohl hier nicht gezeigt, wahrscheinlich Muskelentfernung verbessert auch Antikörper Zugriff auf die Epidermis und DA-Neuronen, die Qualität der Immunfluoreszenz zu verbessern. Größere Antikörper Zugänglichkeit kann besonders nützlich sein für Immunofluoreszenz-Protokolle in der Absen ausgeführtce eines Gewebes permeabilisierender Mittel 4.
Die Verbesserungen, gewonnen durch die Verwendung dieses Protokolls sind wahrscheinlich Untersuchungen der neuronalen und epidermalen Faktoren zu profitieren, die Dendriten Morphogenese in sensorischen Neuronen regulieren. Darüber hinaus hat Muskelentfernung zuvor elektro Untersuchung von sensorischen Neuronen im Larvenkörperwand erleichtert und eine modifizierte Version dieses Protokolls kann nützlich für zukünftige Studien, die neurophysiologischen Manipulation von larvalen sensorischen Neuronen verwenden. Schließlich kann eine modifizierte Version dieses Protokolls gegenüber anderen Anwendungen wie beispielsweise die Isolierung von einzelnen Neuronen da für Genexpressionsprofilen nützlich sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Gary Laevsky für hilfreiche Diskussionen über die Mikroskopie. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert gewährt R01GM061107 und R01GM067758 zu ERG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
