Borttagning av<em> Drosophila</em> Muskelvävnad från larver filéer för immunofluorescensanalys av sensoriska neuroner och epidermala celler
Summary
Studier av neuronala morfogenes med hjälp av Drosophila larver dendritiska arborization (da) neuroner dra nytta av in situ visualisering av neuronala och epidermala proteiner genom immunofluorescens. Vi beskriver ett förfarande som förbättrar immunofluorescensanalys av da nervceller och omgivande epidermala celler genom att ta bort muskelvävnad från larvkroppen väggen.
Abstract
Drosophila larver dendritiska arborization (da) nervceller är en populär modell för att undersöka mekanismer för neuronal morfogenes. DA-neuroner utvecklas i kommunikation med de epidermala cellerna de innerverar och därmed sina analys förmåner från in situ-visualisering av både neuronalt och epidermally uttryckta proteiner genom immunofluorescens. Traditionella metoder för att framställa larver filéer för immunofluorescens experiment lämnar intakt muskelvävnaden som täcker större delen av kroppen väggen, presenterar flera utmaningar att avbilda neuronala och epidermala proteiner. Här beskriver vi en metod för att avlägsna muskelvävnad från Drosophila larver filéer. Detta protokoll möjliggör avbildning av proteiner som annars skyms av muskelvävnad, förbättrar signal-brusförhållandet, och underlättar användningen av super-upplösning mikroskopi för att studera da neuron utveckling.
Introduction
Drosophila larver dendritiska arborization (da) neuroner ger en värdefull modell för att studera neuronal utveckling på grund av deras mottaglighet för genetisk manipulation och den lätthet med vilken de kan avbildas. Dessa sensoriska neuroner har varit avgörande för identifieringen av många vägar som styr dendrit morfogenes 1-3.
Fyra klasser av DA-neuroner (klass I – IV) innerverar larver överhuden. Dessa nervceller ligger mellan basalmembranet och epidermis, med sina dendriter bildar i stort sett tvådimensionella arrayer 4,5. Av de fyra klasser, klass IV da nervceller har de höggradigt grenade hållare och, som sensoriska neuroner av andra djur, utarbetandet av dessa hållare kräver inneboende faktorer samt signaler från angränsande vävnader, särskilt epidermis, för deras utveckling 6-9 .
Studier för att avgöra hur en sådan neuronal och extra-neuronal faktumorer styra dendrit morfogenes dra nytta av möjligheten att detektera proteinuttryck in situ genom immunofluorescens. Den yttre nagelband av larven är ogenomtränglig till antikroppar, men detta hinder är lätt övervinnas genom framställning av larver filéer genom väletablerade dissekering metoder 10,11. Men kroppen väggen muskler som ligger bara inre till basalmembranet presenterar flera utmaningar mot visualisering av da nervceller och hudceller. Först muskelvävnaden, vilka linjer de flesta av kroppen väggen, skymmer kraftigt fluorescerande signalerna från neuronal eller epidermal vävnad. Detta reducerar väsentligen den signal-brusförhållandet i provet. För det andra kan många relevanta proteiner uttryckas i muskelvävnaden såväl som i de neuroner eller epidermis. Denna muskel härrörande fluorescenssignal är sannolikt att ytterligare dunkla detektering av en fluorescenssignal från neuron eller epidermis. Slutligen framsteg inom mikroskopi tekniker intew tillstånd avbildning av prover på under diffraktion upplösning och kan vara särskilt användbart i kräsna lokalisering av proteiner som uttrycks i neuroner och omgivande epidermala celler 12,13. Men avbildning via super-upplösning mikroskopi nytta av en stark signal till brusförhållande och närhet av provet täck. Förutom att minska signalbrusförhållandet, larvkroppen väggmuskel avstånd DA-neuroner från täckglas, vilket därigenom begränsar den förbättrade bildupplösning som kan uppnås med superupplösning mikroskopimetoder. Förutom utmaningar för immunofluorescensanalys, presenterar muskelvävnad en barriär mot elektrofysiologiska inspelning från sensoriska neuroner i larvkroppen väggen. Dess avlägsnande gynnar därför neurofysiologisk manipulation av sensoriska neuroner 14.
Här en metod för manuellt borttagande av Drosophila larv muskelvävnad beskrivs. Vi visar att våra protokoll permits immunofluorescens avbildning av proteiner som annars är dolda av muskelvävnad, förbättrar signal-brusförhållandet för visualisering av klass IV-DA-neuroner, och möjliggör användningen av superupplösning mikroskopi för att bättre särskilja rumsliga förhållanden av proteiner och cellulära strukturer i DA-neuroner och epidermis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här ett protokoll beskrivs för manuell borttagning av muskelvävnad från Drosophila larver filéer. Detta protokoll modifierar tidigare beskrivna larver dissekering tekniker 10,11. Efter larven dissekeras i en silikonelastomer maträtt, är den dorsala mittlinjen belägen. En enda pincett stift, i dess platt möjliga orientering, noggrant in mellan muskelvävnad och epidermis, nära ryggens mittlinje. Tången försiktigt dras uppåt för att separera muskelvävnad från en fästpunkt i varje larv …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Gary Laevsky för bra diskussioner om mikroskopi. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R01GM061107 och R01GM067758 till ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
