का निष्कासन<em> ड्रोसोफिला</em> संवेदी न्यूरॉन्स और एपिडर्मल कोशिकाओं के immunofluorescence विश्लेषण के लिए लारवल Fillets से मांसपेशियों के ऊतकों
Summary
ड्रोसोफिला लार्वा वृक्ष के समान द्रुमायण (डीए) न्यूरॉन्स का उपयोग कर न्यूरोनल morphogenesis के अध्ययन immunofluorescence द्वारा neuronal और एपिडर्मल प्रोटीन के सीटू दृश्य में से लाभ। हम एक प्रक्रिया है कि लार्वा शरीर दीवार से मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के द्वारा दा न्यूरॉन्स और आसपास के एपिडर्मल कोशिकाओं के immunofluorescence विश्लेषण में सुधार का वर्णन है।
Abstract
ड्रोसोफिला लार्वा वृक्ष के समान द्रुमायण (डीए) न्यूरॉन्स न्यूरोनल morphogenesis के तंत्र की जांच के लिए एक लोकप्रिय मॉडल हैं। दा न्यूरॉन्स एपिडर्मल कोशिकाओं वे अंदर आना और इस तरह immunofluorescence द्वारा दोनों neuronally और epidermally व्यक्त प्रोटीन के सीटू दृश्य में से उनके विश्लेषण लाभ के साथ संचार में विकसित करना। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों के लिए लार्वा fillets तैयारी के पारंपरिक तरीकों बरकरार छोड़ मांसपेशियों के ऊतकों है कि शरीर की दीवार के सबसे शामिल हैं, इमेजिंग के लिए neuronal और एपिडर्मल प्रोटीन कई चुनौतियां पेश किया। यहाँ हम ड्रोसोफिला लार्वा fillets से मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल प्रोटीन की इमेजिंग कि अन्यथा मांसपेशियों के ऊतकों से छिप कर रहे हैं सक्षम बनाता है, शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार, और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग दा न्यूरॉन विकास का अध्ययन करने की सुविधा।
Introduction
ड्रोसोफिला लार्वा वृक्ष के समान द्रुमायण (डीए) न्यूरॉन्स आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उनके ज़िम्मा और कितनी आसानी से वे imaged किया जा सकता है की वजह न्यूरोनल विकास के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रदान करते हैं। इन संवेदी न्यूरॉन्स कई मार्ग है कि डेन्ड्राइट morphogenesis 1-3 पर नियंत्रण की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है।
दा न्यूरॉन्स के चार वर्गों (कक्षा मैं – चतुर्थ) लार्वा एपिडर्मिस अंदर आना। इन न्यूरॉन्स उनके dendrites मोटे तौर पर दो आयामी arrays 4,5 के गठन के साथ, तहखाने झिल्ली और एपिडर्मिस के बीच झूठ बोलते हैं। चार वर्गों में से, चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स सबसे उच्च branched arbors और अन्य जानवरों के संवेदी न्यूरॉन्स की तरह, है, इन arbors के विस्तार पड़ोसी ऊतकों से आंतरिक कारकों के रूप में अच्छी तरह से cues, विशेष रूप से एपिडर्मिस, उनके विकास के लिए 6-9 की आवश्यकता है ।
अध्ययनों से पता है कि कैसे इस तरह के neuronal और अतिरिक्त न्यूरोनल तथ्य यह निर्धारित करने के लिएओआरएस immunofluorescence द्वारा बगल में प्रोटीन अभिव्यक्ति पता लगाने की क्षमता से डेन्ड्राइट morphogenesis लाभ नियंत्रित करते हैं। लार्वा के बाहरी छल्ली एंटीबॉडी के लिए अभेद्य है, लेकिन इस बाधा को आसानी से अच्छी तरह से स्थापित विच्छेदन तरीकों 10,11 के माध्यम से लार्वा fillets की तैयारी से दूर है। हालांकि, शरीर दीवार मांसपेशियों के ऊतकों कि तहखाने झिल्ली को सिर्फ आंतरिक निहित है दा न्यूरॉन्स और एपिडर्मल कोशिकाओं के दृश्य के प्रति कई चुनौतियों प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, मांसपेशियों के ऊतकों, जो लाइनों शरीर दीवार की सबसे अधिक है, बहुत फ्लोरोसेंट संकेतों न्यूरोनल या एपिडर्मल ऊतक से चलाई obscures। यह काफी हद तक नमूने में शोर अनुपात करने के संकेत कम कर देता है। दूसरा, कई प्रासंगिक प्रोटीन मांसपेशियों के ऊतकों में के रूप में अच्छी तरह से न्यूरॉन्स या एपिडर्मिस में व्यक्त किया जा सकता है। यह मांसपेशियों व्युत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेत न्यूरॉन या एपिडर्मिस से एक प्रतिदीप्ति संकेत के आगे अस्पष्ट का पता लगाने की संभावना है। अंत में, माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों के क्षेत्र में प्रगति कोईउप विवर्तन संकल्प पर नमूने के डब्ल्यू परमिट इमेजिंग और प्रोटीन है कि न्यूरॉन्स में व्यक्त कर रहे हैं के स्थानीयकरण समझदार और एपिडर्मल कोशिकाओं 12,13 आसपास में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। हालांकि, शोर अनुपात और coverslip के लिए नमूना के करीब निकटता के लिए एक मजबूत संकेत से सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी लाभ के माध्यम से इमेजिंग। शोर अनुपात करने के लिए संकेत को कम करने के अलावा, लार्वा शरीर दीवार मांसपेशियों दूरी coverslip, जिससे बेहतर छवि संकल्प है कि सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के तरीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता सीमित करने से दा न्यूरॉन्स। immunofluorescence विश्लेषण के लिए चुनौतियों के अलावा, मांसपेशियों के ऊतकों लार्वा शरीर दीवार में संवेदी न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए एक बाधा प्रस्तुत करता है। इसके हटाने इसलिए संवेदी न्यूरॉन्स 14 के neurophysiological हेरफेर फायदा होता है।
यहाँ ड्रोसोफिला लार्वा मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए एक विधि का वर्णन किया है। हम जानते हैं कि हमारे प्रोटोकॉल पी प्रदर्शितप्रोटीन के ermits immunofluorescence इमेजिंग कि अन्यथा मांसपेशियों के ऊतकों से छिप कर रहे हैं, चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार, और बेहतर दा न्यूरॉन्स में प्रोटीन और सेलुलर संरचनाओं के स्थानिक रिश्तों भेदभाव करने के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग सक्षम बनाता है और एपिडर्मिस।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ एक प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला लार्वा fillets से मांसपेशियों के ऊतकों के मैनुअल हटाने के लिए वर्णित है। इस प्रोटोकॉल पहले से लार्वा विच्छेदन तकनीक 10,11 वर्णित संशोधित करता है। बाद लार्वा एक सिलिकॉन elas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम माइक्रोस्कोपी पर उपयोगी विचार विमर्श के लिए गैरी Laevsky धन्यवाद। यह काम एनआईएच द्वारा वित्त पोषित किया गया R01GM061107 और R01GM067758 अनुदान एर्ग करने के लिए
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
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