fjerning av<em> Drosophila</em> Muskelvev fra Larve Fileter for Immunofluorescensanalyse av sensoriske nevroner og epidermal cellene
Summary
Studier av neuronal morphogenesis hjelp Drosophila larve dendrittiske arborization (da) nevroner nytte av in situ visualisering av nevronale og epidermal proteiner ved immunfluorescens. Vi beskriver en prosedyre som forbedrer immunfluorescens analyse av da nevroner og omkringliggende epidermal cellene ved å fjerne muskelvev fra larve kroppen veggen.
Abstract
Drosophila larve dendrittiske arborization (da) nevroner er en populær modell for å undersøke mekanismer for nevronale morphogenesis. Da nevroner utvikle seg i kommunikasjon med epidermal cellene de innerverer og dermed deres analyse fordeler fra in situ visualisering av både neuronally og epidermally uttrykte proteiner ved immunfluorescens. Tradisjonelle metoder for å forberede larve fileter for immunofluorescence eksperimenter forlater intakt muskel vev som dekker det meste av kroppen veggen, presentere flere utfordringer til bildebehandling nevronale og epidermal proteiner. Her beskriver vi en fremgangsmåte for fjerning av muskelvev fra Drosophila larve filet. Denne protokollen muliggjør avbildning av proteiner som ellers er skjult av muskelvev, forbedrer signal-til-støy-forhold, og muliggjør anvendelsen av super-oppløsning mikroskopi for å studere da neuron utvikling.
Introduction
Drosophila larve dendrittiske arborization (da) nevronene gir en verdifull modell for å studere nerve utvikling på grunn av deres amenability til genetisk manipulasjon og den enkle som de kan avbildes. Disse sensoriske nevroner har vært medvirkende i identifisering av mange veier som styrer dendritt morphogenesis 1-3.
Fire klasser av da nevroner (klasse I – IV) innerverer larvehuden. Disse neuroner ligge mellom basalmembran og epidermis, med sine dendritter som danner stort sett todimensjonale matriser 4,5. Av de fire klasser, klasse IV da neuroner har de mest sterkt forgrenede og arbors, som sensoriske neuroner av andre dyr, utarbeidelsen av disse arbors krever vesentlige faktorer, så vel som signaler fra nærliggende vev, spesielt epidermis, til deres utvikling 6-9 .
Studier for å bestemme hvordan en slik neuronal og ekstra nevronale faktumORS kontrollere Dendritt morphogenesis nytte av muligheten til å oppdage protein uttrykk in situ ved immunfluorescens. Den ytre skjellaget av larven er ugjennomtrengelig for antistoffer, men denne hindringen er lett overvinnes ved utarbeidelse av larver filet gjennom veletablerte disseksjon metoder 10,11. Men kroppsveggen muskelvev som ligger like interiør til basalmembran presenterer flere utfordringer mot visualisering av da nevroner og epidermal cellene. Først, muskelvev, hvilke linjer fleste av kroppsveggen, i stor grad skjuler fluorescente signalene som kommer fra neuronal eller epidermale vev. Dette reduserer vesentlig den signal til støyforhold i prøven. For det andre kan mange relevante proteiner uttrykkes i muskelvev, så vel som i neuronene eller epidermis. Dette muskel-avledede fluorescens-signalet er egnet til å ytterligere utydeliggjøre deteksjon av en fluorescens-signal fra neuron eller epidermis. Til slutt, fremskritt innen mikroskopi teknologier now tillatelse avbildning av prøver på sub-diffraksjon oppløsning og kan være spesielt nyttig i kresne lokalisering av proteiner som er uttrykt i nerveceller og omkringliggende epidermal cellene 12,13. Men bildebehandling via super-oppløsning mikros fordeler fra et sterkt signal til støyforhold og nærhet av prøven til dekkglass. I tillegg til å redusere signal til støyforhold, larve legeme veggmuskel avstander da neuroner fra dekkglass, og begrenser derved den forbedrede bildeoppløsning som kan oppnås med super-oppløsning mikroskopi metoder. Foruten utfordringer for immunfluorescens analyse, presenterer muskelvev en barriere for elektrofysiologisk opptak fra sensoriske nerveceller i larvekroppen veggen. Fjerning fordeler derfor nevrofysiologiske manipulering av sensoriske nevroner 14.
Her en metode for manuell fjerning av Drosophila larve muskelvev, er beskrevet. Vi viser at vår protokoll permits immunfluorescens avbildning av proteiner som ellers er skjult av muskelvev, forbedrer signal-til-støy-forholdet for visualisering av klasse IV da neuroner, og muliggjør bruk av super-oppløsning mikroskopi for å bedre diskriminere romlige forhold mellom proteiner og cellulære strukturer i da nevroner og epidermis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her en protokoll er beskrevet for manuell fjerning av muskelvev fra Drosophila larve filet. Denne protokollen endrer tidligere beskrevet larve disseksjon teknikker 10,11. Etter at larven dissekeres i en silikonelastomer fatet, blir dorsal midtlinjen ligger. En enkelt tang spiss, i sin flat mulig orientering, er nøye inn mellom muskelvev og epidermis, i nærheten av dorsal midtlinjen. Pinsett er trukket forsiktig oppover til eget muskelvev fra en forankringspunkt i hver larve segment av interesse. La…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Gary Laevsky for nyttige diskusjoner om mikroskopi. Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd R01GM061107 og R01GM067758 til ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
