تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em> في فيفو</em> باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق
Summary
البلعمة دبقية أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توازن الأنسجة وعدم كفاية وظيفة أكلة وقد تورط في علم الأمراض. ومع ذلك، تقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي يمثل تحديا تقنيا. قمنا بتطوير تقنية بسيطة ولكنها قوية لرصد وقياس القدرة أكلة من الخلايا الدبقية الصغيرة في إعداد الفسيولوجية على وجه التحديد.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو إجراء تقييم دقيق وتحديد في البلعمة دبقية الجسم الحي. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المقيمين أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS). وأداء مجموعة متنوعة من المهام لضمان الحفاظ على توازن الأنسجة. وتشمل هذه المراقبة المناعي، إفراز عوامل عصبية و، من أهمية محورية، البلعمة 1. البلعمة دبقية أساسية في العديد من الأحداث الهامة خلال تطور الدماغ وشبكية العين، مثل البلعمة من نقاط الاشتباك العصبي غير ذات صلة (التقليم متشابك) وإزالة الخلايا العصبية أفكارك 2-4. وعلاوة على ذلك، وقد تبين البلعمة دبقية صغيرة من الخلايا العصبية التالفة أو أفكارك، والحطام الخلوي، والميكروبات الغازية لأنها ضرورية للحفاظ على الجهاز العصبي المركزي التوازن من خلال سن البلوغ 5. وأخيرا، فقد تورطت البلعمة دبقية في التسبب في العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر والمرتبط بالعمرالضمور البقعي، حيث قيل إن المعيبة أو غير كافية القدرة أكلة يمكن أن تسهم في تراكم اميلويد β (Aβ) لويحات وبراريق شفافة، على التوالي 6،7.
وينظم وظيفة دبقية بإحكام من قبل المكروية، وخاصة من خلال العوامل القابلة للذوبان مثل ورم عامل النمو β أو التفاعلات خلية خلية. الخلايا العصبية تعبير جوهري عدة بروابط سطح الخلية، مثل CD200 وCX3CL1، في حين أن الخلايا الدبقية الصغيرة التعبير حصرا المستقبلات منها CD200R وCX3CR1. هذه المستقبلات تحتوي على immunoreceptor الزخارف تثبيط القائم على التيروزين (ITIMs) في جزء من الخلايا. هذه المانع مستقبلات حيوية لمنع الإفراط في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، التي يمكن أن تسهم في neuroinflammation. وهكذا، في ظل ظروف فسيولوجية طبيعية، والتفاعلات خلية خلية بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة تبقي الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة سكون. أثناء إصابة الأنسجة، ومع ذلك، يمكن أن الخلايا العصبية أسفل تنظيم إكسبression هذه بروابط، وإزالة تأثير كابح بشكل خاص على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. وهكذا وظيفة دبقية (بما في ذلك البلعمة) ترتبط ارتباطا وثيقا المكروية من 8. ومع ذلك، حتى الآن، لا توجد فحوصات موحدة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة في سياق الفسيولوجية أو في الطريقة التي يعيد كامل الجهاز العصبي المركزي المكروية بهم.
وقد وضعت عدة فحوصات لقياس النشاط أكلة من الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، حيث الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية أو خطوط الخلايا الدبقية الصغيرة يتم تربيتها مع الخلايا المستهدفة (على سبيل المثال، الخلايا العصبية أفكارك) أو حبات fluorescently المسمى. ثم يتم تقييم امتصاص الهدف باستخدام الفلورسنت المجهر التصوير أو التدفق الخلوي 9-12. هذه المقايسات تتيح اختبار كيفية التلاعب الدوائي أو وراثية قد تؤثر على البلعمة دبقية صغيرة، وبينما غنية بالمعلومات، تفشل لتكرار تماما المجمع في بيئة الجسم الحي. طرق غير مباشرة لدراسة البلعمة دبقيةفي الجسم الحي وقد تم الإبلاغ عن: يتم إنجاز هذه تلوين جزيئات يعتقد أن تشارك في البلعمة (على سبيل المثال، CD68)، وتقييم القرب المادي من الخلايا الدبقية الصغيرة والأهداف لالبلعمة (على سبيل المثال، الخلايا العصبية للخطر أو عناصر متشابك)، أو عن طريق كشف المناعى من أكلة أهداف داخل الخلايا دبيقي (على سبيل المثال، Aβ) 13-17. وقد استخدمت دراستين نهج أكثر مباشرة لتقييم الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة في الجسم الحي. وقد استخدمت هيوز ورفاقه تقنيات التصوير لقياس امتصاص دبقية من الخرز تسليمها عبر الطريق داخل الجمجمة 18. سييرا وآخرون بتطوير أسلوب دقيق لتقييم كمي البلعمة الخلايا الدبقية الصغيرة من الخلايا أفكارك باستخدام تقنيات التصوير المعقدة 4. ومع ذلك، هذه الطرق تتضمن بروتوكولات معقدة لإعداد الأنسجة، باجتزاء، والتصوير، والتحليل. لقد استخدمت سابقا تحليل cytometric تدفق لتقييم البلعمة من مبصرة خارجشرائح إيه بواسطة خلايا الشبكية الظهارة الصباغية (RPE) في الثقافة (19). هنا، نحن تصف بروتوكول لتقييم امتصاص بسرعة fluorescently المسمى الجسيمات من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين كإجراء الكمي في الجسم الحي الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة.
البروتوكول وصفنا هنا يسمح لقياس موثوقة والكمي للالبلعمة دبقية صغيرة في شبكية العين في أقل من ست ساعات في ثلاث خطوات حاسمة: (1) تسليم intravitreal من جزيئات fluorescently المسمى، (2) الحصاد وإعداد أنسجة الشبكية، و (3) تدفق تحليل cytometric. طريقة وضعنا هو وسيلة قوية لتقييم البلعمة دبقية صغيرة في شبكية العين، ويمكن استخدامه بنجاح لاختبار مدى مختلف المركبات أو التلاعب الجيني تغير هذه الوظيفة دبقية الرئيسية في إعدادات الفسيولوجية. كمجال متخصص في الجهاز العصبي المركزي، وشبكية العين هو نظام نموذجي للوصول بسهولة إلى دراسة وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة 20. في حين تم تطوير هذه الطريقة في تيانه عين، فإننا نعتقد أنه يمكن أن تكون مفيدة لجميع علماء الأعصاب التحقيق وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة أكلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك ثلاث خطوات حاسمة في هذا الأسلوب: (1) حقن intravitreal من جزيئات fluorescently المسمى. (2) الحصاد وإعداد أنسجة الشبكية. و (3) تحليل تدفق cytometric. من المستحسن أن الباحثين ممارسة حقن intravitreal قبل أداء طريقة يمكننا في هذا المقام. الفئران البيضاء (على سبيل المثال، BALB / ج)، وإيجاد حل الل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
